舒肝丸由川楝子、醋延胡索、白芍、片姜黄、木香、沉香、豆蔻仁、砂仁、姜厚朴、陈皮、枳壳、茯苓、朱砂共13味中药组成，各药味经粉碎后，加入不同的辅料精制成大蜜丸、小蜜丸、水蜜丸或水丸。临床上主要用于舒肝和胃、理气止痛等。现《中国药典》（2015年版）收载该药品的质量标准^[1]中检验项目包括：显微鉴别，朱砂理化鉴别，延胡索、陈皮、厚朴、木香的薄层色谱鉴别及白芍中芍药苷的高效液相色谱法含量测定。该质量标准检验内容在《中国药典》（2005年版）后无相关修订，检验方法较为陈旧。查阅文献报道的质量标准研究内容仅测定芍药苷^[2]或延胡索乙素^[3]的含量，无定性项检验；参考骨痹止痛液等质量标准完善提高的文献^[4-8]中报道的对厚朴、延胡索定性鉴别研究及益胃颗粒等文献^[7-11]报道的对芍药苷定量测定的研究，对本品的质量标准进行全面提高完善，修订了延胡索、陈皮、厚朴的薄层色谱鉴别，建立了更高效快捷的芍药苷HPLC法含量测定项。新方法缩短了分析时间、节约了检验成本，提高检验效率，为舒肝丸的质量标准制定提供科学依据。

1 仪器与试药 1.1 仪器

Linomat-5半自动点样仪（CAMAG公司）；LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；KQ-400KDE超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；AE240型电子天平（上海梅特勒仪器有限公司）；薄层板：硅胶G薄层板（10×10cm，青岛海洋化工厂分厂）；色谱柱：Thermo Acclaim C18（250 mm×4.6 mm，5μm；美国戴安公司）。

1.2 试药

延胡索对照药材（批号：120928-201208）、芍药苷对照品（批号：110736-201035，含量96.4%）、橙皮苷对照品（批号：110721-201014，含量95.3%）、厚朴酚对照品（批号：110729-200412）、厚朴酚对照品（批号：110730-201313）均购自中国食品药品检定研究院。

舒肝丸样品三批购自市场（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号3015234；哈药集团世一堂制药厂，批号1506107；颈复康药业集团有限公司，批号395034，编号Ⅰ~Ⅲ）。川楝子、醋延胡索、白芍（酒炒）、片姜黄、木香、沉香、豆蔻仁、砂仁、姜厚朴、陈皮、枳壳（炒）、茯苓、朱砂经本院中药室段吉平主任药师鉴定。

甲醇、乙腈（色谱纯，Merck公司）；水用去离子水；其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果 2.1 薄层色谱鉴别 2.1.1 陈皮

取本品水丸2.5 g或水蜜丸4 g，研碎；或取小蜜丸、大蜜丸6 g，剪碎，加甲醇40 mL，加热回流30 min，滤过，取滤液1 mL，作为供试品溶液。另取橙皮苷对照品，加甲醇制成饱和溶液，作为对照品溶液。按处方比例称取除陈皮外其他药材适量，制成缺陈皮的阴性样品，同供试品溶液制备方法制成缺陈皮的阴性对照溶液。照薄层色谱法（附录Ⅵ B）试验，吸取对照品溶液2μL、供试品溶液及阴性对照溶液各5μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以三氯甲烷-丙酮-甲醇（5：1：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

新旧方法结果对比见图 1，经验证，所得色谱斑点清晰、圆整、分离较好，且阴性无干扰。

2.1.2 延胡索

取陈皮鉴别节下剩余滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，分取10 mL（剩余水液备用），加浓氨试液调制碱性，用乙醚振摇提取2次，每次15 mL，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取延胡索对照药材1 g，加甲醇40mL，加热回流30 min，滤过，滤液蒸干，同法制成对照药材溶液。按处方比例称取除延胡索外其他药材适量，制成缺延胡索的阴性样品，同供试品溶液制备方法制成缺延胡索的阴性对照溶液。照薄层色谱法（附录Ⅵ B）试验，吸取上述对照药材溶液5μL、供试品溶液及阴性对照溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-三氯甲烷-甲醇（7.5：4：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气熏至斑点显色清晰，取出，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

新旧方法结果对比见图 2，经验证，所得色谱斑点清晰、圆整、分离较好，且阴性无干扰。

2.1.3 厚朴

取延胡索鉴别剩余水溶液，加盐酸调至酸性，用乙醚振摇提取2次，每次15 mL，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取厚朴酚对照品与和厚朴酚对照品，加甲醇制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作为对照品溶液。按处方比例称取除厚朴外其他药材适量，制成缺厚朴的阴性样品，同供试品溶液制备方法制成缺厚朴的阴性对照溶液。照薄层色谱法（附录Ⅵ B）试验，吸取上述对照品溶液5μL、供试品溶液及阴性对照溶液各10μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯（3：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

新旧方法结果对比见图 3，经验证，所得色谱斑点清晰、圆整、分离较好，且阴性无干扰。

2.2 芍药苷的含量测定 2.2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Thermo Acclaim C18（250mm× 4.6mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-0.05%磷酸（B），梯度洗脱（0~40 min，15%A→25%A）；柱温：3 5 ℃；检测波长为2 3 0 n m；流速1. 0 ml·min^-1；进样量：5μL；理论板数大于8000；芍药苷与相邻峰的分离度均大于1.5。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取芍药苷对照品0.01011 g，置25 mL量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

取重量差异节下的本品，剪碎，取约0.8g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量，加热回流90 min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

2.2.4 阴性样品溶液的制备

按质量标准处方比例及制备工艺，将药材粉碎后，自行配制缺白芍的阴性样品，并按“2.2.3”节下方法制备溶液，即得。

2.2.5 专属性考察

分别取对照品溶液、供试品溶液及阴性缺味药材溶液进样分析，按“2.2.1”节下色谱条件进样分析，结果样品色谱中与对照品色谱相同保留时间处有色谱峰，而阴性样品相应位置无相应峰，不干扰测定。待测成分与杂质分离度良好。

2.2.6 线性关系考察

取系列浓度对照品溶液，按拟定的色谱条件测定，记录峰面积。以对照品进样量（μg）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归。结果线性方程为y=1.269×106x+1727.45；线性范围为0.03898~0.9476μg；相关系数为0.9999，表明待测成分线性关系良好。

2.2.7 重复性试验

取同一舒肝丸样品约0.64 g、0.8 g、0.96 g各三份，精密称定，按“2.2.3”节下制备9份供试品溶液，分别测定含量，结果样品中芍药苷含量为0.8945 mg·g^-1，RSD为1.4%，结果表明方法重复性良好。

2.2.8 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别在0、2、7、13和20h进样测定，记录峰面积。结果RSD为1.1%，表明供试品溶液中待测成分在室温放置20 h内基本稳定。

2.2.9 回收率试验

采用加样回收法，取“2.2.7”项下已知含量的样品0.4 g，共9份，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，分别精密加入不同浓度的对照品溶液各25ml，按“2.2.3”节下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”节下色谱条件进行分析，计算回收率。结果芍药苷的平均回收率（n=9）为100.5%，RSD为1.5%，表明方法回收率良好，方法可行。

2.2.10 样品测定结果对比

取3批舒肝丸样品，分别按现标准^[1]及拟修订标准（即按“2.2.3”节下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”节下色谱条件进行测定）测定芍药苷含量，结果对比见表 1。

3 讨论 3.1 薄层色谱鉴别方法的优化

三个薄层色谱鉴别均为舒肝丸现行标准收录的检验项目，但方法繁琐，毒性试剂使用率高、使用量大，如陈皮使用甲苯作为展开剂；延胡索的样品前处理用苯加热回流时间为2 h，展开剂系统也使用了苯，费时，不环保，而且按标准检验结果显示薄层色谱斑点不清晰；厚朴样品前处理过程萃取次数达9次，而且频繁使用三氯甲烷，展开系统中也使用了苯。优化后的薄层色谱鉴别方法可以共用1份样品，经过不同极性的溶剂振摇提取后，按样品中化学成分的极性大小富集，分别进行薄层色谱鉴别，简化了操作，大大节约样品用量，大幅节约检验成本。

3.2 含量测定方法的优化

现行标准^[1]及文献报道^[12]的芍药苷高效液相色谱法含量测定中，流动相使用的磷酸缓冲盐（取5份0.067 mol·L^-1的磷酸氢二钠溶液，用约1份0.067 mol·L^-1的磷酸二氢钾溶液调节pH为7.4）配制繁琐；供试品溶液制备的过程中，样品经过超声提取后，采用大孔树脂柱净化、浓缩，试验过程繁琐。而优化后的含量测定方法，以乙腈-水-磷酸为流动相，样品仅需超声处理，大大提高了工作效率。

3.3 小结

舒肝丸现行标准收载项目虽较为完善，但鉴别及含量测定试验中，样品的处理及检测方法操作复杂，薄层色谱鉴别样品提取及薄层板展开过程中苯、甲苯等毒性试剂使用率高，含量测定项中结果易受样品净化过程中柱填料（GDX－201型大孔吸附树脂）影响而致重现性差。因此，探索方便、快捷及更高效的检测方法十分必要，本研究建立了环保高效的薄层色谱鉴别方法及操作简单、重现性好的含量测定方法，为舒肝丸现行标准的提升打下良好基础。