巴日嘎-13散由凤眼草、芒果日-吉木斯（芒果核）、哈黑日各-乌热（海南蒲桃）、卓楞-乌热（大托叶云实）、查干-苏格木勒（豆蔻）、薄仁-芍沙（刀豆）、玛日那（茜草^[1]）、阿如拉（诃子）、额勒吉根（枇杷叶）、乌日格斯图-阿日查（刺柏叶）、巴嘎-阿拉坦其其格（波棱瓜子）^[2]等13味药组成，具有清肾热、消肿的功能，用于肾损伤性热、血尿、睾丸肿痛等病证的治疗。大托叶云实暧胃、温肾；芒果核及海南蒲桃具有补肾、祛“巴干达”寒的功能；刀豆益肾、清肾热；茜草具有清血热、止泻、止血功能，用于血热、吐血、衄血、崩漏、子宫出血、侵入性肾及肺热、麻疹、肠刺痛和肠热腹泻。茜草在方中起到主要功效作用，茜草中含有的抗癌成分^[3]：β-谷甾醇、二氢大叶茜草素、大叶茜草素、2-甲氧酰基-2, 3-环氧基-3-异戊烯基-1, 4-奈醌、大黄素甲醚、齐墩果酸等，其中大叶茜草素为茜草的主要有效成分，本研究参照文献^[4-16]以大叶茜草素作为对照品，建立了巴日嘎-13散蒙成药中大叶茜草素的含量测定方法。通过方法学考察及阴性对照试验，表明该方法操作简单、重复性好、专属性强，方中其它组分对大叶茜草素的测定无干扰。

1 仪器与试药 1.1 仪器

Dikma Dimonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）CBM-20A系统控制器，LC-20AT溶剂输送泵，SIL-20AC自动进样器，SPD-20AV紫外检测器、CTO-20A柱温箱，LCsolution色谱工作站。普析通用TU-1901型紫外-可见分光光度仪。HR-200型万分之一天平。Presia型十万分之一天平。

1.2 试剂与试药

大叶茜草素对照品（C₁₇H₁₅O₄）（中国食品药品检定研究院提供，批号：110884-200604，供含量测定用）；甲醇为色谱纯；四氢呋喃为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。巴日嘎-13散（锡盟蒙医研究所提供，批号：070123、080225、090427）。

2 方法和结果 2.1 色谱条件

色谱柱：Dikma Dimonsil C18色谱柱（250mm×4.6 mm，5μm）。流动相：甲醇-四氢呋喃-水（527:90:3），流速: 1.0 mL·min^-1，柱温：室温，检测波长：391 nm，进样量：20 μL。理论板数按大叶茜草素峰计算应不低于5000。分离度为2.58。

2.2 对照品溶液的制备

取大叶茜草素对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为20 μg·mL^-1的溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取本品1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，浸泡过夜，超声处理（功率：250 W，频率：33 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得（注意避光操作^[5]）。

2.4 阴性供试品溶液的制备

按巴日嘎-13散处方比例配制缺茜草的样品作为阴性供试品，取1.5 g，精密称定，按“2.3”节下供试品溶液的制备方法制成阴性供试品溶液。

2.5 专属性试验

分别精密吸取对照品、供试品、阴性供试品溶液20µL进样，按上述色谱条件测定，结果阴性供试品的色谱图中，未出现与对照品（大叶茜草素）色谱峰保留时间相同的色谱峰，表明方中其他组分对大叶茜草素的测定无干扰，该方法专属性强。见图 1。

2.6 线性关系考察

精密称取大叶茜草素对照品11.00mg，置100mL棕色量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分别置10 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，各取20µL进样，按上述色谱条件测定，峰面积为纵坐标，对照品的进样量为横坐标绘制标准曲线。回归方程：
Y=1.345781×10⁶x+1.0021×10⁴ r=0.9999
结果表明，大叶茜草素在5.5~55 μg·mL^-1范围内呈良好的线性关系。

2.7 精密度试验

精密吸取同一大叶茜草素对照品溶液20μL，连续进样6次，测定峰面积积分值，计算峰面积平均值为594777，RSD为0.32%。

2.8 稳定性试验

取同一供试品溶液，精密吸取20μL，分别于配置后0、2、4、8、12 h测定大叶茜草素峰面积，计算峰面积平均值为580460，RSD为0.27%。

2.9 重复性试验

精密称取样品（批号：090427）6份，同法制成供试品溶液并测定。结果大叶茜草素平均含量为0.3753 mg·g^-1，RSD为1.28%。

2.10 回收率试验

精密称取已知含量的同一批号（批号：090427，含量：0.3753 mg·g^-1）的样品0.77 g，分别精密加入大叶茜草素对照品溶液一定量，按供试品溶液的制备方法制备及上述色谱条件测定，计算回收率为102.24%，RSD为1.48%。结果见表 1。

2.11 含量测定

取大叶茜草素对照品溶液与供试品溶液各20μL进样测定，采用外标法计算，测定结果见表 2。

3 讨论 3.1 提取溶剂的选择

大叶茜草素易溶于三氯甲烷、苯、乙酸乙酯，能溶于乙醚、甲醇、丙酮，稍溶于乙醇，不溶于水^[17]。由于三氯甲烷、苯、乙酸乙酯溶解的非极性的杂质较多，且三氯甲烷、苯的毒性较大，结合文献^{[1, 4-5]}选择用甲醇浸泡过夜超声提取。

3.2 测定波长的选择

实验中曾参照文献^{[1, 4]}选用250 nm作为检测波长进行高效液相色谱法含量测定的条件探测，但因阴性干扰大，样品分离效果差，保留时间长，故未采用250 nm作为检测波长，而采用另一个最大吸收波长391 nm作为检测波长，结果阴性无干扰，样品分离效果好，保留时间适宜，故选择391nm作为检测波长。

3.3 浸泡时间的选择

分别考察了浸泡60、90、120 min以及浸泡过夜，在不同浸泡时间对提取效率的影响，结果表明浸泡过夜再用同样超声条件可以提取完全。

3.4 定量成分的选择

因芒果核、海南蒲桃、大托叶云实、诃子、波棱瓜子等多种药味均含有没食子酸，专属性差，故未选择没食子酸作为指标成分进行含量测定的研究；又因枇杷叶、刺柏叶等药味均含有槲皮素，专属性差，故未选择槲皮素作为指标成分进行含量测定的研究。