传统藏医药是极具民族特色的生命科学，藏药产业是民族地区独具特色和少数具有国际优势的产业之一^[1]。藏药现代化战略的实施强有力地推动了藏药产业的发展。由于历史原因，藏药科技基础相对薄弱，成方制剂工艺粗放、质控技术落后等，严重制约了藏药品种做大做强^[2]。七味诃子散系藏族验方，由诃子(去核)、波棱瓜子、木棉花、草果、丁香、甘松、荜茇7味药材组成，具有清热、镇痛的作用，用于劳伤引起的脾脏肿大、疼痛、脾热等症。该品种收载于《卫生部药品标准》（藏药）1995年版第一册^[3]，标准编号WS3-BC-0220-95；另外《青海省藏药标准》1992年版也有收载，其质量标准中仅规定了性状和检查项, 均无含量测定项，亦未见文献报道。该处方的君药为诃子^[4-5]，原计划对诃子中没食子酸进行含量测定^[6-9]，通过试验发现丁香^{[4, 10]}中也含有少量的没食子酸^[11-12]，对阴性有干扰，故用RPHPLC测定了丁香中有效成分丁香酚的含量作为定量检测指标^[13]。文献^[14-16]报道丁香酚具有抗菌、降血压等多种活性。笔者参照相关文献标准^[17]，采用高效液相色谱法（HPLC法）测定了七味诃子散的有效成分丁香酚的含量，该方法简便、灵敏、准确，且重现性好，可作为衡量七味诃子散质量的一项重要指标。

1 仪器与试药

LC-20ATVP高效液相色谱仪及工作站（日本岛津公司）；XS105DU电子天平（梅特勒-托利多）。

丁香酚对照品（中国食品药品检定研究院，批号110725-200610）；甲醇为色谱纯；水为三重蒸馏水，七味诃子散（西藏雄巴拉曲神水藏药厂，批号20100701、20100702、20100703、20100704、20100705、20100706）。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Luna 5μ C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇－水（55 : 45）；流速：1 mL·min^-1；检测波长：280 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL；丁香酚的保留时间为13.4 min（见图 1）。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取丁香酚对照品0.44062 g，置50 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，得8.8124 mg·mL^-1丁香酚溶液作为对照品储备液。精密吸取对照品储备液2.0 mL，置50 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取10.0 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇定容，即得对照品溶液（质量浓度为0.1410mg·mL^-1)。

2.3 供试品溶液的制备

将本品研细，取0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称量，超声处理（功率200 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称量，用甲醇补足减失的量，0.45 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 空白试验

按七味诃子散制备方法制成缺丁香的阴性对照品，再按“2.3”节供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液，并按上述色谱条件进行检测。结果在丁香酚对照品相同保留时间处无干扰峰出现（图 1-C），表明处方中其余6味药材对丁香酚的测定无干扰。

2.5 线性关系考察

精密吸取丁香酚对照品溶液4、8、12、18、20 μL，参照“2.1”节下色谱条件进样。以峰面积（Y）对进样量（X）进行线性回归，得回归方程：

Y=981654X + 8370.5 r=0.9999

结果表明，丁香酚进样量在0.564~2.820 μg范围内与峰面积响应值呈良好线性关系。

2.6 稳定性试验

取样品按“2.3”节下方法制成供试品溶液，按“2.1”节下色谱条件分别在0、2、4、6、8 h测定，结果丁香酚峰面积的RSD为0.20%，表明在内供试品溶液稳定性良好。

2.7 重复性试验

取同一批号的样品6份，每份0.5 g，精密称定，按“2.3”节下方法制备溶液并进行测定。结果丁香酚的含量平均值为14.9 mg·g^-1，RSD为1.39%。

2.8 精密度试验

取对照品溶液，按“2.1”节下色谱条件连续进样测定6次，计算丁香酚峰面积的RSD为0.13%。

2.9 加样回收率试验

采用加样回收法，精密称取已知含量的样品（批号为20100703，测得含量为14.9 mg·g^-1）适量共9份，按低、中、高浓度（每个浓度3份），分别准确加入丁香酚对照品溶液适量，按“2.3”节下方法制成供试溶液，按“2.1”节下方法进行测定，用外标法计算丁香酚的量及加样回收率，结果见表 1。

2.10 样品测定

取6个批号七味诃子散，分别按“2.3”节下方法制成供试品溶液并按上述色谱条件测定峰面积，按外标法计算样品的含量，结果见表 2。

3 讨论 3.1 检测波长的选择

HPLC法测定丁香酚的含量，需选择适当的检测波长。利用高效液相色谱-二极管阵列（DAD），根据丁香酚的光谱图进行选择，丁香酚在（280±2）nm、（203±2）nm处有最大吸收。因在280 nm处基线较为稳定，本试验选取280 nm作为检测波长（见图 2）。

3.2 流动相的选择

在选用流动相时，试用了多种比例的乙腈-水、甲醇-水、水-甲醇-乙腈等流动相的分离效果，最终确定以甲醇-水（55 : 45）为优，分离效果较好，且无干扰。

3.3 样品的处理

本试验对七味诃子散样品的提取方法进行筛选时，考察了甲醇、乙醇、醋酸乙酯3种溶剂提取的效果，结果表明甲醇提取效果最好；分别采用加热回流提取、超声处理、索氏提取3种方法进行提取，结果采用超声提取效果好，且超声提取方法操作简便、省时。另考察了不同提取时间（20、30、50 min），发现只需超声提取30 min即可将本品中丁香酚提取完全，含量并未随着提取时间延长而有所增加，超过30 min时含量甚至有下降的趋势。故最终选择以甲醇为提取溶剂，超声30 min为最佳提取方法。

3.4 标准提高的迫切性

青海藏药多源于藏医传统验方和藏医名著，受历史和工艺影响，标准现代化升级进程缓慢，特别是一些临床过硬的品种如“七味诃子散”因为缺乏基础性研究，药物化学成分、安全性、稳定性研究不透彻，严重影响了藏药的有效推广。针对七味诃子散中丁香的有效成分丁香酚的含量测定项增加到质量标准中可显著提高药品质控水平，保证临床疗效。七味诃子散现行标准中无含量测定项，会导致生产企业质量控制水平低下，生产工艺不规范，通过增加丁香酚的含量测定项能精准控制工艺参数，显著提高藏药七味诃子散的品质^[18-20]。

3.5 小结

用HPLC法测定七味诃子散中丁香酚的含量，经方法学研究表明，此方法具有样品预处理提取完全，回收率、重复性、稳定性好及专属性强等优点，可作为七味诃子散质量标准检测方法。