虾仁富含蛋白质、碳水化合物、脂肪及钙、磷、铁等微量元素，具有补肾壮阳、滋阴健胃、通畅血脉之功效，临床上用于治疗肾虚阳痿、筋骨疼痛、皮肤瘙痒、脾胃虚弱等症^[1]。目前，在虾仁生产源头虾的养殖过程中，由于养殖户不规范不正确使用药物，四环素族抗生素如土霉素（OTC）、四环素（TC）、金霉素（CTC）可能被超限量应用于水产生物的养殖中，造成这类药物在水产品中的超量残留。人若长期食用，药物不断在体内蓄积，当浓度达到一定量后，就会对人体产生不良作用，主要表现为对胃、肠、肝脏的损害及牙齿的染色等，还会造成过敏反应、二重感染、致畸胎等作用^[2]。对畜、禽肉类中土霉素、四环素、金霉素的测定，有国家标准方法GB·T5009 116-2003^[3]；对于非干制品水产品中土霉素、四环素、金霉素的测定，虽然也有报道^[4-5]，但这些方法用于水产干制品的处理效果都不太理想。基于以上情况，本文在这些研究内容的基础上，通过改变色谱条件和样品前处理方法，建立了一种同时测定土霉素、四环素、金霉素3种抗生素的高效液相色谱方法。该法不仅能有效去除样品中的干扰杂质从而保护色谱柱，而且使检测限大大降低，适用于测定水产干制品中土霉素、四环素、金霉素含量，也为制定虾仁的质控标准提供了参考依据。

1 仪器与试药 1.1 仪器

2 0 1 0 A H T型高效液相色谱仪(日本岛津公司），TDL-50B离心机(北京亚泰科隆公司），LV型自动蒸发浓缩仪（美国，TurboV ap），AS3120B型超声波清洗器（天津，奥特赛恩斯仪器有限公司），MS2型迷你振荡器（德国IKA公司）。

1.2 试药

标准物质：土霉素批号130487-200703、四环素批号130303-201419、金霉素批号130489-200202，购自中国食品药品检定研究院。5批样品分别为日本对虾（标示产地山东乳山）、凡纳滨对虾（标示产地山东乳山）、中国对虾（标示产地山东乳山）、北极虾（标示产地山东烟台）和脊尾白虾（标示产地山东乳山），均购自山西省太原市水产品市场，经山西省农业科学院植物保护研究所动物专家鉴定。

试剂：乙腈、甲醇(进口色谱纯)购自迪马公司。

自配：乙二胺四乙酸二钠（EDTA）-Mcllvaine缓冲液，配置方法：[取乙二胺四乙酸二钠37.2 g，加Mcllvaine缓冲溶液（pH 4）溶解至1000 mL。Mcllvaine缓冲溶液（pH 4）配置方法:称取磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·12H₂O）276 g、柠檬酸（C₆H₈O₇·H₂O）129 g，用水溶解后稀释并定容至1000 mL]。三氯乙酸-水（1:1）

色谱柱为Inertsil ODS-3液相色谱柱C18（填料十八烷基硅胶250 mm×4.6 mm，5μm; 日本岛津）；液固萃取柱（Waters Oasis HLB 6cc/200 mg固相萃取柱WAT106202；美国waters公司）；0.45 μm微孔滤膜（美国agela公司）13 mm。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱：C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；柱温：30 ℃; 流动相：甲醇-乙腈-10 mmol·L^-1三氟乙酸，梯度洗脱程序见表 1。检测波长：350 nm；进样量：20 μL。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取本品粉末（过4号筛）5. 0 g，置50 mL离心管中，加入25 mL EDTA-Mcllvaine缓冲液[Mcllvaine缓冲溶液（pH 4）：称取磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·12H₂O）276 g、柠檬酸（C₆H₈O₇·H₂O）129 g、乙二胺四乙酸二钠372 g，用水溶解后稀释并定容至1000 mL]，冰水浴振荡10 min后，加入5mL三氯乙酸-水（1:1），以2000 r·min^-1的速度离心2 min，等静置分层后，5000 r·min^-1离心20 min，取上清液，向残渣中再加入10 mL缓冲液，2 mL三氯乙酸-水（1:1），经冰水浴超声波振荡提取10 min，5000 r·min^-1离心10 min，重复上述操作，合并上清液。

取新的固相萃取小柱（重复使用的小柱用甲醇、5% EDTA-2Na溶液交替冲洗，甲醇浸泡保存），用3 mL甲醇清洗小柱，再用10 mL 5%EDTA-M cllvaine溶液、10 mL蒸馏水依次淋洗，然后将上述滤液分次通过固相萃取小柱（流速2 mL·min^-1），再用20 mL 5%甲醇溶液冲洗除去杂质，最后用50 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，于自动蒸发浓缩仪上45℃氮吹浓缩至0.2 mL，用0.01 mol·L^-1柠檬酸溶液定容至1 mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤，供HPLC分析。

2.3 对照品溶液的制备

准确称取适量土霉素、四环素、金霉素标准物质，用甲醇溶解，使成为1.0 mg·mL^-1的标准储备液, 于0~4 ℃避光保存。

分别吸取上述土霉素、四环素、金霉素储备液各0.50 mL，于50 mL容量瓶中用甲醇定容至刻度，混合对照品溶液含土霉素、四环素、金霉素各10.0μg ·mL^-1。

2.4 精密度试验

取对照品溶液，按上述方法进行重复测定（n=6），计算精密度，其相对标准偏差（RSD）分别为土霉素1. 4 2 %，四环素1. 3 7 %，金霉素2.10%。

2.5 方法的检出限

以3倍信噪比计算检出限, 四环素、土霉素为5 μg·kg^-1，金霉素为20 μg·kg^-1；四环素、土霉素比国标方法^[3]降低10倍，金霉素降低2.5倍。

2.6 线性关系考察

准确吸取上述混合对照品溶液0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 mL分别置于100 mL容量瓶中，加甲醇2 mL，用0.01 mol·L^-1柠檬酸溶液定容至刻度，得到含土霉素、四环素、金霉素0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、4.00 μg·mL^-1，的标准系列溶液。在上述色谱条件下测定，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。

土霉素、四环素在0.05~1.00 μg·mL^-1浓度范围内呈线性关系，金霉素在0.20~4.00 μg·mL^-1浓度范围内呈线性关系，其线性方程和相关系数见表 2。

2.7 加样回收率试验

在不含3种四环素类抗生素的虾仁样品中，加入不同浓度范围的土霉素、四环素和金霉素标准品，再按样品提取和测定方法，测定3种抗生素含量，计算加标回收率。结果见表 3、图 1~2。

2.8 样品测定结果

对市场上购得的5批样品进行检测，由于样品代表性问题，5批样品中土霉素、四环素、金霉素均未检出。

3 讨论 3.1 流动相的选择

国标方法^[3]中使用乙腈-0.01 mol·L^-1磷酸二氢钠溶液（pH 2.5）（35:65），经试验分离效果不理想；采用梯度洗脱，能使3种抗生素各峰分离完全，且峰形良好，保留时间稳定。

3.2 固相萃取条件的选择

固相萃取条件的选择主要是洗脱液的选择。根据文献资料报道^[4]，分别用5%、20%、50%、100%甲醇溶液作洗脱液，进行HPLC测定，所选定的最佳洗脱液为5%甲醇溶液（用纯甲醇配置）。

3.3 提取液的选择

经比较，在相同的条件下，Mcllvaine缓冲液的提取效率优于其他缓冲液，因为四环素类抗生素易与二价金属离子形成配合物，且四环素类抗生素的性质属于酸碱两性物质，易与蛋白质发生缔合作用，需用强酸或酸性蛋白提取，但是酸性过强（pH＜2），四环素类药物又易发生降解，并且可以结合生物样品中的蛋白质，形成不溶性、难吸收的络合物；在碱性条件下则易生成分子异构体；而通常在弱酸性溶液中比较稳定，所以应该选择含金属络合剂的弱酸性提取液。

3.4 样品前处理方法的选择

比较不经固相萃取及经固相萃取的样品HPLC谱图发现，经过固相萃取柱纯化并浓缩的样品，杂质峰较少，土霉素峰、四环素峰清晰，并可看到金霉素峰；而未经固相萃取的样品土霉素峰、四环素峰很低，杂质峰多，检测不到金霉素。故本方法具有选择性强、分离时间短、使用有机溶剂少、不发生乳化现象等优点。

3.5 检测波长的选择

据报道^[6]，四环素类化合物含有苯环、酮基和烯醇组成的共轭体系，具有两个发色团，在近可见光区（350 nm附近）具有强的紫外吸收。土霉素、四环素、金霉素3种抗生素在260和350 nm两个波长附近都有吸收峰，在260 nm附近的吸收最大，但因为杂质在短波长吸收较大，因此选择了350 nm为3种抗生素共同的检测波长。

采用本方法对样品前处理方法进行改进, 与国标方法相比较，在取样量没有增加的情况下对样品进行浓缩处理，并调整流动相比例，采用梯度洗脱，能使各色谱峰避免受杂质峰的干扰，得到良好的分离，保留时间稳定，线性范围好，精密度和准确度均获得满意的结果，能满足水产干制品的分析要求，具有实际应用价值。