丁香为桃金娘科植物丁香Eugenia caryophyllata Thunb.的干燥花蕾，当花蕾由绿转红时采摘^[1]。丁香亦名公丁香、丁子香、鸡舌香，为常用中药。目前，市场上丁香主要产于印度尼西亚、马达加斯加等地，为进口药材。我国广东、广西、海南等地曾有栽培。丁香入药历史悠久，是我国传统进口“南药”之一。丁香具有温中降逆，补肾助阳的功效。用于脾胃虚寒，呃逆呕吐，食少吐泻，心腹冷痛，肾虚阳痿^[2]。丁香的主要成分丁香酚具有抑菌、麻醉、解热、抗氧化、抗肿瘤等多种药理活性^[3-4]。丁香除作为药用外，还是食品中常用的调味料之一，安全无毒，对食品中的腐败菌有良好的抑制和杀灭效果，在食品中的应用也越来越广泛^[5-6]。

丁香收载于《中国药典》2015年版一部，为本单位2017年国家评价性抽验品种。研究中发现不法分子为获取利润，将丁香花梗采用焦糖色素进行染色后混入样品中。由于中药材市场经营比较混乱，药材和饮片掺杂染色的现象比较常见^[7-9]，但关于丁香掺杂染色的情况未见报道。丁香表面颜色为棕褐色或褐黄色，其未被染色的杂质颜色为浅棕色，两种颜色相差较大，极易区分。而染色后的花梗颜色与丁香颜色相似，消费者难以区分。而现标准虽有杂质检查项目，但缺少适宜指标用于控制杂质量及反映非法染色状况。

焦糖色素又名焦糖色，是一种浓黑褐色粘稠物质，属于食品添加剂的范畴^[10]。如可乐类饮料独特的棕褐色、酱油中的色泽便是来自焦糖色素。考虑到焦糖色素为一复杂混合物，难以采用标准物质对其进行定性。在以亚硫酸铵为原料生产焦糖色素时，会产生副产物含氮杂环咪唑类化合物4-甲基咪唑等。在大剂量情况下能导致动物长肿瘤，有可能给人体带来致癌风险^[11-12]。4-甲基咪唑不是丁香固有的化学成分，但由于人为掺入染有焦糖色素的杂质后，焦糖色素生产中的副产物4-甲基咪唑便引入样品中，严重影响丁香使用安全^[13-14]。为此，对丁香中的4-甲基咪唑进行研究。本文系采用质谱作为检测器，采用多反应监测扫描方式，提高了分析灵敏度，建立了液质联用的检测方法来确证杂质是否有被染色情况，以有效遏制掺假、造假的行为，提高丁香饮片的质量，保证人民群众的用药安全和有效。

1 仪器与试药 1.1 仪器

Agilent 1200快速液相色谱仪-API4000串联质谱仪（配ESI源，G1312B二元高压泵，G1367D自动进样器，G1315C检测器，G1379B真空在线脱气机，G1316B柱温箱），Sartorius BT 25S、BSA124S-CW电子天平（德国Sartorius公司），KQ-500E型超声波仪（40 kHz，500 W，昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

4-甲基咪唑（中国食品药品检定研究院，批号：190150-201501）。甲醇（美国Sigma公司）为色谱纯，甲酸（美国Fluka公司）为色谱纯；水为Milli-Q制备的超纯水，其余试剂均为分析纯，丁香饮片样品为2017年中药饮片专项抽验工作抽样，共160批。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Luna C-18（2 mm×150 mm，3μm）；流动相：甲醇（A）－0.1%甲酸水溶液（B），按照表 1梯度洗脱；流速：0.3 mL·min^-1；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。

2.2 质谱条件

电喷雾电离离子源（ESI），正离子模式检测，电喷雾电压为5500 v；干燥气温度500 ℃，气帘气：20 psi；碰撞气：6 psi；其他质谱参数见表 2。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取4-甲基咪唑对照品9.40 mg，置50 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为对照品母液。精密量取上述对照品母液0.5 mL，置10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取上述对照品储备液0.1 mL，置10 mL量瓶中，加丁香基质溶液（取未染色的丁香杂质1.0 g，研成粉末，置具塞锥形瓶中，加入水10 mL，密塞，超声处理20 min，摇匀，离心，滤过，取续滤液即得）至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备

取丁香1.0 g，研成粉末，置具塞锥形瓶中，精密加入水10 mL，密塞，超声处理20 min，摇匀，离心，滤过，即得。

2.5 阴性样品溶液的制备

取未染色的丁香样品，按“2.4”节供试品溶液制备方法，制成阴性样品溶液。

2.6 测定方法

取对照品溶液，进样5 μL，注入液质联用仪，记录所得质谱MRM色谱图（见图 1）。

取供试品溶液，进样5 μL，注入液质联用仪，记录所得质谱MRM色谱图（见图 2）。

取阴性样品溶液，进样5 μL，注入液质联用仪，记录所得质谱MRM色谱图（见图 3）。

2.7 方法学研究

按照欧盟委员会指令96/23/EC对定性分析的要求，选取1个母离子及其2个子离子或2个母离子及其各1个子离子，并依据子离子相对丰度比即离子比（定性离子/定量离子）和化合物的保留时间来定性^[15]。因此，本方法以m/z 83.0为母离子，对母离子进行轰击以获得二次碎裂产生的子离子，选择丰度较高、干扰较小的离子对m/z 83.0＞56.2，83.0＞42.2作为定性离子对，选择离子丰度最高的离子对m/z 83.0＞56.2作为定量离子对。

2.7.1 线性关系考察

取4-甲基咪唑对照品储备液稀释成系列对照品溶液（浓度为10、25、50、100、200、400 ng·mL^-1），进样测定。以浓度为横坐标，定量离子对的峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程：

表明4-甲基咪唑在9.28~371.11 ng·mL^-1浓度范围内呈良好的线性关系。

2.7.2 精密度试验

取对照品溶液连续进样6次，测定峰面积，结果4-甲基咪唑色谱峰峰面积RSD为0.6%，表明仪器精密度良好。

2.7.3 稳定性试验

取阳性供试品溶液一份，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，测定峰面积，结果4-甲基咪唑色谱峰峰面积RSD为1.8%。表明供试品溶液中4-甲基咪唑在24 h内稳定。

2.7.4 重复性试验

取同一批号阳性检出（批号：160901）供试品，按“2.4”节供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，测定峰面积，结果4-甲基咪唑含量的RSD为1.2%。表明该方法重复性良好。

2.7.5 检测限和定量限

取4-甲基咪唑对照品溶液逐级稀释后进样测试，以信噪比3:1的溶液浓度来确定检测限（LOD）为26 μg·kg^-1；以信噪比10:1的溶液浓度来确定定量限（LOQ）为87 μg·kg^-1。

2.7.6 回收率试验

精密称取已知含量（4-甲基咪唑含量为0.67 mg·kg^-1）的供试品6份，每份约0.5 g，分别精密加入4-甲基咪唑对照品储备液（9.28 μg·mL^-1）40 μL，依法测定，计算回收率，测得4-甲基咪唑的平均回收率为96.91%，RSD=1.0%，表明方法准确度良好。

2.7.7 样品测定

采用上述方法对本次所收集160批次的丁香饮片进行测定，结果发现31家企业生产的33批次样品检出4-甲基咪唑（含量在0.03~8.71 mg·kg^-1），提示这些企业涉嫌非法添加焦糖色素，存在质量风险。在另外未检出4-甲基咪唑的127批次样品中随机选取15批次，对挑出来的杂质和去除杂质后的纯丁香分别进行检测，结果均未检出4-甲基咪唑，表明丁香及杂质本身不含4-甲基咪唑。另外，对上述检出4-甲基咪唑的33批次样品，再对其去除杂质后的纯丁香进行了测定，结果显示有9批次检出4-甲基咪唑，说明染色杂质中的焦糖色素会迁移到纯丁香中。

3 讨论

1）丁香混入染色的非药用部位（花梗），即使净制后，采用本方法仍有可能检出4-甲基咪唑，表明此方法具有较强的灵敏度；另外，本方法采用纯水超声处理样品，提取方式简便快捷，所测结果重复性好，准确度高，适用于丁香杂质中4-甲基咪唑的定性确证及定量分析。

2）4-甲基咪唑的化学结构中含有氨基，在ESI源电离下容易获得H⁺，形成[M+H]⁺，故本试验选择ESI源正离子模式检测。另外，在ESI⁺模式下，往往会在流动相中加入可以提供H⁺的甲酸或乙酸等，以提高目标化合物的离子化效率，故本试验中水相为0.1%甲酸水溶液。由于4-甲基咪唑的极性大、分子量小，与固定相C18之间的相互作用力较差，故采用甲醇作为有机相，甲醇-0.1%甲酸水溶液（2:98）作为初始比例洗脱，以延长4-甲基咪唑的保留时间。

3）药典标准中有丁香杂质控制项目，利用杂质检查虽然可以对丁香的质量进行一定控制，但是无法反映其是否存在染色、掺杂增重等违法情况，给消费者带来一定的潜在风险。通过液质联用方法对杂质中4-甲基咪唑进行测定，可以快速判定丁香是否被掺杂染色，也为国家市场监管提供技术支持，规范药材和饮片市场，以确保药材和饮片的安全性和有效性。