2017, Vol. 31 
2. 贵州省遵义市食品药品检验所, 遵义 563002
2. Zunyi Institute for Food and Drug Control, Zunyi 730070, China
菥蓂，现收载于《中国药典》2015年版一部中，为十字花科菥蓂属一年生草本植物菥蓂Thlaspi arvense L.的干燥地上部分[1]，又名遏蓝菜、苏败酱（江苏）、南败酱（湖北）、苦芥子、败酱草、爪子草、野榆树、菥目（陕西），分布于全国各地，其全草、嫩苗和种子均可入药。全草清热解毒、消肿排脓；嫩苗和中益气、利肝明目。菥蓂始载于《神农本草经》，列为上品，之后历代本草多有记载[2-3]；《中国药典》 1977年版作为正名，别名“苏败酱”，以区别于败酱科败酱草，具有清肝明目、和中、解毒的功效，用于目赤肿痛，消化不良，脘腹胀痛，肝炎，阑尾炎，疮疖痈肿[4]。河南、广西、湖南等地方标准收载了该药材，《卫生部药品标准》中收载了菥蓂子，为该药材的干燥成熟种子[5-9]。菥蓂主要含有黑芥子苷等硫苷类成分，异荭草苷、异牡荆苷等黄酮碳苷类成分[10-12]。菥蓂的指纹图谱和含量测定研究报道较少。陈玉等[13]采用HPLC法测定了菥蓂子中的黑芥子苷含量；庞赛等[14]以异牡荆苷为参照峰建立了菥蓂的HPLC指纹图谱。
异荭草苷具有较好的体内外抗病毒活性，能一定程度上缓解病毒性炎症[15]；异牡荆苷具有抗氧化、降血糖、抗炎等活性[16]。针对《中国药典》2015年版一部菥蓂项下缺少含量测定项目，本研究针对市场上抽取的菥蓂药材，采用恒流HPLC法30 min内完成洗脱，建立菥蓂的指纹图谱，并同时测定2种黄酮碳苷异荭草苷和异牡荆苷（结构式见图 1）的含量，为菥蓂药材的质量控制提供科学依据。
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图 1 结构式 1.异荭草苷；2.异牡荆苷。 |
沃特世2695型高效液相色谱仪，紫外检测器，P120H型超声波清洗器（德国ELMA公司），Milli-Q纯水系统，电子天平（Sartorius公司，SECURA224-1CN型万分之一天平），电子天平（Sartorius公司，MSE125S型十万分之一天平）。Waters HSS T3色谱柱（填料：十八烷基键合硅胶，250 mm×4.6 mm，5 μm；沃特斯仪器公司）。
1.2 试药异荭草苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111974-201401，纯度94.0%)、异牡荆苷（上海源叶生物技术有限公司，批号：P20N6FC331，纯度99.6%）。甲醇和乙腈为色谱纯（Fisher公司）；水为Milli-Q纯化水。
1.3 样品药材均来自2016年国家药品抽验性评价项目的抽验样品，经中国食品药品检定研究院民族药室郑健研究员鉴定。1~13号样品为十字花科菥蓂Thlaspi arvense L.的干燥地上部分。
2 溶液的制备 2.1 混合对照品溶液取异荭草苷和异牡荆苷约10 mg，精密称定，分别置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得各对照品储备液。分别取各对照品储备液适量，置同一10 mL量瓶中，加乙腈配制成上述2种成分分别为20、50 μg·mL-1的混合溶液，即得。
2.2 供试品溶液取样品粉末（过四号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理（功率：250 W，频率：33 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3 色谱条件Waters HSS T3色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.5%醋酸水溶液（15：85）为流动相；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为350 nm；柱温为30 ℃；进样量为10 μL。
4 指纹图谱 4.1 菥蓂指纹图谱的建立取不同批次的菥蓂（1~13号样品）粉末，按“ 2. 2 ”节方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，进样测定，记录30 min的HPLC色谱图（见图 2）。根据结果，采用Chempattern化学计量学软件进行数据分析处理，设定1号样品的图谱为参照图谱，将其他样品的色谱图与参照图谱进行自动匹配，根据共有峰的平均色谱图生成菥蓂的指纹图谱（图 3）。
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图 2 13批菥蓂HPLC色谱图 |
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图 3 菥蓂HPLC指纹图谱 1、2、5.未知成分待进一步研究；3.异荭草苷；4.异牡荆苷。 |
根据13批菥蓂的指纹图谱检测结果，共标定5个特征峰。经过与对照品比对，可知3号峰为异荭草苷，4号峰为异牡荆苷。
4.3 方法学考察 4.3.1 精密度试验精密吸取同一菥蓂供试品溶液（样品1）10 μL，按上述色谱条件，连续进样测定6次，记录色谱图。以异牡荆苷为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰的相对保留时间的RSD＜1%，单峰面积占总峰面积大于2%的特征峰的相对峰面积RSD＜2%，采用科迈恩（北京）科技有限公司Chempattern化学计量学软件进行评价，相似度（夹角余弦法，下同）为0.99，结果表明仪器精密度良好。
4.3.2 稳定性试验精密吸取同一菥蓂供试品溶液（样品1）10 μL，分别于溶液配制后0、2、4、6、8、12、24 h，按上述色谱条件进样测定，记录色谱图。以异牡荆苷为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰的相对保留时间的RSD＜1%，单峰面积占总峰面积大于2%的特征峰的相对峰面积RSD＜2%，采用Chempattern化学计量学软件进行评价，相似度为0.99，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
4.3.3 重复性试验取同一批菥蓂样品粉末（样品1）6份，精密称定，按“2.2”节方法分别制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μL，进样测定，记录色谱图。以异牡荆苷为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰的相对保留时间的RSD＜1%，单峰面积占总峰面积大于2%的特征峰的相对峰面积RSD＜2%，采用Chempattern化学计量学软件进行评价，相似度为0.99，结果表明，该方法重复性好。
4.4 相似度评价以样品1为参照图谱，生成菥蓂药材的指纹图谱，13批菥蓂药材与指纹图谱的相似度见图 4，相似度分别为1.000、0.999、0.975、0.974、0.862、0.862、0.932、0.932、0.837、0.838、0.938、0.938和0.989，结果表明相似度较好。
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图 4 菥蓂药材相似度计算结果 |
按“3”项下色谱条件进行检测，以异牡荆苷峰计算理论塔板数大于6000，分离度大于1.5。对照品及样品的色谱图见图 5。
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图 5 菥蓂HPLC含量测定色谱图 A.对照品混合溶液；B.供试品溶液；3.异荭草苷；4.异牡荆苷。 |
精密吸取各对照品储备液0.02、0.1、0.05、0.5、1.0、2.0 mL，分别置于6个10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得各系列浓度的混合标准溶液。分别精密吸取各系列浓度的标准溶液及对照品储备液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，以各对照品质量浓度（μg·mL-1）为x轴，以峰面积为y轴，进行线性回归，各对照品回归方程和线性范围见表 1。结果表明，2种成分在一定质量浓度范围以内，进样量与峰面积线性关系良好。
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表 1 各被测成分的标准曲线方程、线性范围和相关系数 |
取“2.1”节混合对照品溶液用甲醇逐级稀释后进样测定，以色谱图中信噪比3：1为检测限，信噪比10：1为定量限。结果表明，异荭草苷和异牡荆苷的检测限分别为0.8和1.1 ng；定量限分别为2.1和2.8 ng。
5.4 精密度试验精密吸取“2.1”节对照品混合溶液10 μL，连续进样6次，记录峰面积。结果异荭草苷和异牡荆苷峰面积的RSD分别为0.29%和0.25%（n=6），表明仪器精密度良好。
5.5 重复性试验取样品粉末（样品1）6份，分别按照“2.2”节方法制备供试品溶液，按“3”项下色谱条件测定，记录峰面积，计算含量。结果供试品溶液的异荭草苷和异牡荆苷平均含量分别为0.023%和0.090%，RSD分别为1.57%和1.95%，结果表明重复性良好。
5.6 溶液稳定性试验取同一份供试品溶液（样品1），分别于配制后0、2、4、8、12、24 h进样测定。结果异荭草苷和异牡荆苷峰面积的RSD（n=6）分别为0.72%和0.52%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。
5.7 加样回收率试验分别取异荭草苷和异牡荆苷适量，精密称定，置量瓶中，加甲醇溶解配制成质量浓度分别为0.1089、0.4448 mg·mL-1的对照品溶液。取已知含量的供试品粉末（样品1）6份，每份各约0.5 g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入上述2种对照品溶液各1.0 mL，按照“2.2”节方法平行制备供试品溶液，进样分析，计算回收率，结果见表 2~表 3，表明该方法加样回收试验结果良好。
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表 2 异荭草苷加样回收率试验结果（n=6） |
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表 3 异牡荆苷加样回收率试验结果（n=6） |
每批样品取2份，分别按“2.2”节方法制备供试品溶液。精密吸取各供试品溶液10 μL，按“3”项下色谱条件进行测定，13批菥蓂样品中异荭草苷和异牡荆苷的含量结果见表 4。
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表 4 13批菥蓂中异荭草苷和异牡荆苷含量测定结果（n=2） |
本研究采用等度洗脱色谱法分离菥蓂药材中2种主要黄酮碳苷类成分，30 min内完成分离，异荭草苷和异牡荆苷分离效果良好，符合含量测定要求。本研究通过二极管阵列检测器考察所测物质紫外吸收，2种待测成分具有相同的结构母核，主要是取代基不同，紫外最大吸收均在350 nm，因此，选择350 nm为检测波长。
6.2 指纹图谱分析13批菥蓂均含有5个特征峰，通过对照品比对法，标定了2种黄酮碳苷类成分，各批次之间HPLC图谱与指纹图谱之间的相似度较好，可用于菥蓂的质量控制。
6.3 含量测定从表 4异荭草苷和异牡荆苷测定结果来看，异荭草苷含量在0.015%~0.094%，平均为0.042%；异牡荆苷含量在0. 0 3 4 % ~ 0. 3 2 3 %，平均为0.152%；二者总含量在0.050%~0.418%，平均为0.195%。异牡荆苷含量均高于异荭草苷含量，二者比值在2.0~5.6倍，平均为3.9倍，该比值具有一定的鉴别意义。
该方法简单方便、准确性高，建议可作为药典含量测定方法。异荭草苷和异牡荆苷二者含量之和作为测定限度较为合理，并可确定异荭草苷和异牡荆苷含量之和不低于0.10%作为指标。按此限度，测定的13批样品，第6和9批次含量较低，低于限度，其余11批符合限度要求。
6.4 小结本试验在同一色谱条件下，建立了菥蓂药材的指纹图谱，并同时测定13批药材中异荭草苷和异牡荆苷的含量，方法简便、快速、准确，具备了定性和定量双重作用，为有效控制菥蓂的质量提供了科学依据。
| [1] |
中国药典: 一部[S]. 2015: 308.
|
| [2] |
青海省藏医药研究所, 青海省药品检验所. 中国藏药[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 1996: 337-341.
|
| [3] |
中国药品生物制品检定所, 云南省药品检验所, 内蒙古自治区药品检验所, 等. 中国民族药志:第二卷[M]. 北京: 人民卫生出版社, 1990: 465-469.
|
| [4] |
中国药典: 一部[S]. 1977: 524-525.
|
| [5] |
河南省卫生厅. 河南省中药材标准[S]. 郑州: 中原农民出版社, 1991: 82-83.
|
| [6] |
河南省食品药品监督管理局. 河南省中药饮片炮制规范[S]. 郑州: 河南人民出版社, 2005: 322-323.
|
| [7] |
湖南省食品药品监督管理局. 湖南省中药材标准[S]. 长沙: 湖南科学技术出版社, 2009: 307.
|
| [8] |
广西壮族自治区食品药品监督管理局. 广西壮族自治区壮药质量标准: 第二卷[S]. 2011: 257-258.
|
| [9] |
国家药典委员会. 卫生部药品标准藏药第一册[S]. 1995: 90.
|
| [10] |
潘正, 高运玲, 刘毅, 等. 菥蓂的化学成分研究[J]. 中成药, 2013, 35(5): 995-997. |
| [11] |
丁建海, 张俊芳. 菥蓂的化学成分及药理作用研究[J]. 宁夏师范学院学报:自然科学, 2014, 35(3): 78-81. |
| [12] |
于金英, 王云红, 刘国强, 等. HPLC-ESI-MS/MS分析鉴定菥蓂中黄酮类成分[J]. 中成药, 2015, 37(3): 556-561. |
| [13] |
陈玉, 周旻, 伍丽萍, 等. HPLC测定菥蓂子中的黑芥子苷[J]. 华西药学杂志, 2012, 27(1): 94-95. |
| [14] |
庞赛, 王立升, 史新, 等. 菥蓂药材中异牡荆苷的分离鉴定及指纹图谱研究[J]. 广东农业科学, 2012(1): 105-107. |
| [15] |
朱秀珍, 史文伟, 龚翠莹, 等. 异荭草苷体内外抗呼吸道合胞病毒活性研究[J]. 中山大学学报:医学科学版, 2015, 36(5): 352-359. |
| [16] |
闫冲, 林励, 刘红菊, 等. HPLC研究异牡荆苷在大鼠体内的药代动力学及组织分布[J]. 中国药学:英文版, 2011, 20(4): 376-382. |