小儿咳喘灵颗粒具有宣肺、清热,止咳、祛痰、平喘功效。用于上呼吸道感染、气管炎、肺炎、咳嗽等。由麻黄、金银花、苦杏仁、板蓝根、石膏、甘草、瓜蒌7味处方组成[1]。现行标准为部颁标准第四册及18个企业注册标准。中药制剂的活性成分含量高低是反映其有效性的重要指标,部颁标准第四册未对其进行控制,部分注册标准即使对金银花的含量进行了测定,也存在提取方法、色谱条件、限度规定差异较大和指标单一的问题。为达到对多味药材、多个活性成分的有效控制,有必要统一采用HPLC法,开展金银花(绿原酸、木犀草苷)、甘草(甘草苷)、板蓝根(R,S-告依春)的含量测定[2-8],以达到更有效地控制产品质量,保证临床用药安全有效的目的。
1 仪器与试药仪器:Waters 2695-2996 HPLC高效液相色谱仪,PDA检测器。
试药:乙腈为色谱纯;水为纯化水;其他试剂均为分析纯。
对照品:R,S-告依春、绿原酸、甘草苷、木犀草苷(供含量测定用;批号分别为:111753-2010304、0753-9910、111610-201106、111720-200602;含量分别为:99.9%、100%、93.7%、100%),均购于中国食品药品检定研究院。
样品:小儿咳喘灵颗粒(批号:15021337,神威药业集团有限公司)及2015年国家计划抽验样品小儿咳喘灵颗粒210批。
2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱:迪马Inertsil C8-3柱(4.6 mm×250 mm,5μm);以乙腈为流动相A,0.5%乙酸溶液为流动相B,按表 1中的规定进行梯度洗脱;检测波长:DAD检测器,木犀草苷(327 nm)、绿原酸(327 nm)、甘草苷(276 nm)、(R,S)-告依春(245 nm);流速:0.6 mL·min-1;理论板数按木犀草苷峰计算应不低于20000。
![]() |
表 1 流动相梯度洗脱表 |
取本品适量,研细,取5 g,精密称定,精密加入70%甲醇20 mL,称定重量,超声处理(功率250 W,频率33 kHz)30 min,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
2.3 对照品溶液的制备取R,S-告依春、绿原酸、甘草苷、木犀草苷对照品适量,精密称定,分别加70%甲醇制成每1 mL含20、100、100、20 µg的溶液,即得。
2.4 专属性试验分别取处方中除金银花、甘草、板蓝根外的全部药味,按本品制法及供试品溶液的制备方法分别制备金银花、甘草、板蓝根阴性对照溶液,注入液相色谱仪进行测定,结果表明:阴性对照溶液无干扰,专属性良好,见图 1~6。
![]() |
图 1 供试品HPLC色谱图,0~30min 245 nm30~70 min 327 nm;70~74 min 276 nm;74~100 min 327 nm 1.告依春;2.绿原酸;3.甘草苷;4.木犀草苷 |
![]() |
图 2 对照品溶液HPLC色谱图,0~60 min;245 nm;60~100 min;327 nm 1.告依春;4.木犀草苷 |
![]() |
图 3 对照品溶液HPLC色谱图,0~60 min;327 nm;60~100 min;276 nm 2.绿原酸;3.甘草苷 |
![]() |
图 4 阴性(缺金银花)对照HPLC色谱图,327 nm |
![]() |
图 5 阴性(缺甘草)对照HPLC色谱图,276 nm |
![]() |
图 6 阴性(缺板蓝根)HPLC色谱图,245 nm |
精密吸取R,S-告依春(0.01704mg·mL-1)、绿原酸(0.1928 mg·mL-1)、甘草苷(0.2056 mg·mL-1)、木犀草苷(0.0167mg·mL-1)对照品溶液,按不同进样量依法测定,以峰面积值(A)为纵坐标、进样量(μg)为横坐标绘制标准曲线,分别测得回归方程:
$ {y_{{\rm{R,S}} - 告依春}} = 1.995 \times {10^7} + 69661,\;\;r = 0.9999 $ |
$ {y_{绿原酸}} = 5.176 \times {10^6} + 17472,r = 0.9999 $ |
$ {y_{甘草苷}} = 2.9701 \times {10^6} + 89647,r = 0.9999 $ |
$ {y_{木犀草苷}} = 3.3438 \times {10^6} + 8945,r = 0.9999 $ |
结果表明,R,S-告依春在0.00341~0.1704µ g、绿原酸在0.03856 ~ 1.928 µ g、甘草苷在0.04112 ~ 2.056 µ g、木犀草苷在0.00334~0.167 µg,有良好的线性关系,见表 2。
![]() |
表 2 线性关系考察结果表(n=2) |
取同一供试品(批号:15021337)溶液,同一进样量,连续进样5次,结果平均峰面积分别为942819、5367676、2379660、161919.8,RSD分别为0.19%、0.55%、0.51%及0.27%,结果表明仪器精密度良好。
2.7 稳定性考察取同一供试品(批号:15021337)溶液,分别于配制后0、5、10、12、24 h,测定峰面积,峰面积平均值分别为938111.8、5267222、2365475、160802,RSD分别为0.33%、0.82%、0.67%及0.58%,表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.8 重复性考察按拟订含量测定方法,对同一批号(批号:15021337)的6份样品进行平行试验,测定结果表明该方法的重复性良好,见表 3。
![]() |
表 3 重复性考察结果(n=6) |
采用加样回收法,取上述重复性试验所用的样品(批号15021337)2.5 g(9份),精密称定,分别精密加入一定量对照品,按拟定含测方法制备,依法测定,计算回收率,结果见表 4~7。
![]() |
表 4 R,S-告依春回收率测定结果(n=2) |
![]() |
表 5 绿原酸回收率测定结果(n=2) |
![]() |
表 6 甘草苷回收率测定结果(n=2) |
![]() |
表 7 木犀草苷回收率测定结果(n=2) |
依法对210批次样品进行测定,测得结果见表 8。
![]() |
表 8 抽验6批次以上不同企业样品多指标含量比较(n=2) |
根据R, S-告依春、绿原酸、甘草苷、木犀草苷标准溶液S/N=3及S/N=10时的溶液浓度,分别计算出4种成分的检测限和定量限,结果见表 9。
![]() |
表 9 检测限、定量限考察结果(n=3) |
[1] |
中华人民共和国卫生部药典委员会. 中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第四册[S]. 1991: 19.
|
[2] |
中国药典: 一部[S]. 2015.
|
[3] |
刘敏彦, 高淑丽, 张丽华, 等. HPLC法同时测定不同产地金银花和山银花中6种有机酸成分[J]. 中药材, 2013, 36(2): 196-198. |
[4] |
张昀, 胡海延, 刘欣. 板蓝根药材及其制剂中告依春稳定性研究[J]. 河南大学学报(医学版), 2014, 33(1): 21-23. |
[5] |
方宇, 张昀, 李钦. 感冒解毒灵颗粒中(R, S)-告依春的稳定性研究[J]. 中成药, 2013, 35(7): 1484-1486. |
[6] |
陈钢, 侯世祥, 胡平. 金银花提取物中绿原酸的稳定性研究[J]. 中国中药杂志, 2014, 28(3): 223-226. |
[7] |
涂北平, 赖卫华. 高纯度绿原酸的稳定性研究[J]. 江西化工, 2011(3): 52-54. |
[8] |
霍文杰, 李卫民, 高英. 干燥方法对金银花中绿原酸、木犀草苷及总黄酮含量的影响[J]. 广州中医药大学学报, 2014, 30(5): 737-739. |