壮药金钮扣Spilanthes paniculata Wall.ex DC.（曾用名：Spilanthes acmella auct.non L.）系菊科植物金钮扣的全草，别名雨伞草、散血草、山天文草、大黄花、苦草等。味辛、苦，性微温，小毒，具有止咳平喘，解毒利湿，消肿止痛的功效，用于治疗感冒咳嗽、哮喘、百日咳、肺结核、痢疾、肠炎、疟疾、疮疖肿毒、风湿性关节炎、牙痛、跌打损伤、毒蛇咬伤等^[1]。主产于广西、福建、台湾、广东等地，是广西瑶、壮族人民常用的中草药。颜萍花等^[2]对金钮扣的质量标准进行了初步探讨，但无含量测定方面的研究。本文采用HPLC法对金钮扣中的绿原酸进行含量测定，发现在不同产地、不同采收时节中绿原酸的含量差异较大。绿原酸具有抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗心血管疾病、抗氧化、降血糖、免疫调节等药理作用^[3-4]，故本文首次采用薄层色谱法进行定性鉴别、高效液相色谱法进行含量测定，为其建立质量标准提供参考。

1 仪器与试药 1.1 仪器

Waters 2695-2487型高效液相色谱仪，Empower Pro工作站（美国Waters公司）；AS7240BT超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；METTLER XS205电子分析天平（瑞士梅特勒公司）。色谱柱为Waters公司SunFire C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）。

1.2 试剂

对照品绿原酸(批号：110753-201314)，购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用，含量96.6%。薄层层析硅胶G板购自青岛海洋化工有限公司（粘合剂：CMC-Na；规格：20cm×20cm；厚度：500μm）。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.3 药材

采集金钮扣药材1 3批，经广西中医药大学中药鉴定教研室蔡毅教授鉴定为金钮扣Spilanthes paniculata Wall.ex DC.，以采自玉林市兴业县批号为20131007的样品为对照药材。详细信息见表 1。

2 方法与结果 2.1 金钮扣药材的TLC鉴别

取本品粉末（过二号筛）1 g，加70%甲醇20 mL，超声提取30 min，滤过，取滤液浓缩至1 mL，作为供试品溶液。另取金钮扣对照药材（JNK-4）1 g，同法制成对照药材溶液。另取绿原酸对照品，用甲醇溶解，制成对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0502）试验，吸取对照品溶液、对照药材溶液及供试品溶液各3μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸丁酯-乙酸乙酯-甲酸-水（11:3:1.5:1.5）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光（365 nm）灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。色谱图见图 1。

2.2 金钮扣药材中绿原酸的含量测定 2.2.1 色谱条件

色谱柱：Waters SunFire C18（4.6 mm×250 mm，5μm），柱温30℃；流动相乙腈-0.4%磷酸溶液（10:90），流速1.0 mL·min ^-1；检测波长：327 nm；进样量为10μL^[5]。

2.2.2 系统适用性试验

按上述实验条件进行测定，结果理论板数按绿原酸峰计均不低于5000，且与杂质达到基线分离，分离度大于2.0。色谱图见图 2。

2.2.3 对照品溶液制备

精密称取绿原酸对照品10.52 mg置20 mL量瓶中，加7 0 %甲醇溶解并定容，摇匀，作为对照品储备液；精密吸取储备液1 m L于50 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，摇匀，即得（10.16 μg·mL^-1）。

2.2.4 供试品溶液制备

取本品药材（JNK-1）粉末（过三号筛）1.0 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，精密加入70%甲醇溶液25 mL，称定重量，超声处理30分钟，取出，放冷，用70%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，过0.45μm滤膜，即得。

2.2.5 线性关系考察

精密量取“2.2.3”节对照品储备液5 mL于50 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，摇匀，精密吸取1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mL分别置25 mL量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度（约相当于绿原酸2.032、5.081、10.16、15.24、20.32、25.40 μg·mL^-1）摇匀，进样10μL进行分析，记录峰面积。以对照品浓度C（μg ·mL^-1）为横坐标，以色谱峰峰面积Y为纵坐标，制作标准曲线，求得标准曲线的回归方程：

$ Y = 3.59 \times {10^4}X + 9.16 \times {10^3}\;\;\;r = 0.9995 $

结果表明绿原酸在2.032~25.40 μg·mL^-1线性关系良好。

2.2.6 精密度试验

精密吸取对照品溶液，连续进样6次，每次10 μL，以峰面积计，RSD为0.4%。表明该方法精密度良好。

2.2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0、2、8、12、20、24 h进样测定，以峰面积进行计算，结果RSD为2.1%。表明供试品溶液中绿原酸在24 h内稳定性良好。

2.2.8 重复性试验

取同一样品（J N K -1）各6份，分别按“2.2.4”节方法制备供试品溶液，进样10 μL，测定。结果样品中绿原酸平均含量（n=6）为0.1165 mg·g^-1；RSD为1.1%。表明该方法重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验

精密称取同一批（JNK-1）已知绿原酸含量为0.1165 mg·g^-1的样品0.5 g，共6份，分别精密加入“2.2.5”节下对照品溶液（浓度20.32μg·mL^-1）2.0 mL，按“2.2.4”节方法操作，制备供试溶液，测定，计算回收率。结果见表 2。

2.2.10 样品测定

按“2.2.4”节制备供试品溶液及检测方法，测定13批金钮扣药材中绿原酸的含量，其含量在0.042~0.741 mg·g^-1范围内，结果见表 3。

3 讨论 3.1 薄层色谱鉴别方法的考察

曾参照《中国药典》 ^[5]中金银花的鉴别方法，将药材粉末加甲醇5 mL放置12 h提取，以乙酸丁酯-甲酸-水（7:2.5:2.5）的上层溶液为展开剂，结果对照品和样品的Rf值非常小，且斑点不清晰。参考相关文献^[6-8]，且经过不断试验，最后以70%甲醇超声30 min提取供试液，以乙酸丁酯-乙酸乙酯-甲酸-水（11:3:1.5:1.5）为展开剂，节约了提取时间，且Rf值适中，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，可作为金钮扣药材中绿原酸的薄层色谱鉴别方法。

3.2 含量测定方法的考察

为了选定最佳的含量测定供试液制备方法，本文分别用乙醇（超声、回流）、甲醇（超声、回流）提取30 min，发现用甲醇超声提取为较佳条件；之后分别用10%、30%、50%、70%、90%甲醇超声提取30 min，结果发现用70%甲醇为溶剂最佳；在提取时间的选择上，用70%甲醇为溶剂，分别提取10、30、45、60 min，结果发现提取30 min时，样品中绿原酸含量最高，且杂质峰相对较少，故本文选择用70%甲醇提取30 min为含量测定中供试液的制备方法。

将绿原酸作为金钮扣的指标成分进行定性定量方法测定，从本实验方法学结果可知，定性鉴别中，其Rf值适中，斑点清晰；含量测定中，其线性、重现性、重复性、稳定性等结果良好，可为金钮扣质量标准的建立提供参考。

4 结论

本文以绿原酸作为指标成分，对13批金钮扣进行薄层色谱定性鉴别和含量测定，结果TLC斑点清晰，与杂质斑点能较好地分离，在取样量和点样量一致的情况下，同一薄层板上的绿原酸斑点大小与含量测定结果相符，如JNK-13斑点较小，其含量也相应低，而JNK-9、JNK-10斑点大，其含量相对较高，说明所选的定性定量方法能较好的反应金钮扣的指标成分绿原酸的内在质量。金钮扣为一年生草本^[1]，本文的13批金钮扣均于4到12月份采自广西各地，从绿原酸的含量可知，不同产地、不同采收时节，金钮扣中绿原酸的含量差异较大，如JNK-13与JNK-9的含量相差了18倍之多。地域的差别、采收时节的不同对其含量有何影响、其影响的规律如何，是笔者下一步讨论的课题。