白益镇惊丸是由茯苓、栀子（炒）、人参、天竺黄等17味中药材加工而成的复方制剂，该制剂为棕褐色的水蜜丸，具有养血安神的功效, 可用于小儿热病体虚、痰鸣气促、抽搐时作、将成慢惊等症状的治疗。

该制剂收载于《卫生部颁药品标准》中药成方制剂第七册，标准仅规定了性状、显微鉴别及理化鉴别，无其他检测项目^[1]。高效液相色谱法同时测定该制剂中多组分的含量未见文献报道。为有效控制白益镇惊丸的质量，确保临床用药的安全有效，本研究建立了一种较为简单、可靠、准确度高的HPLC波长切换法，对白益镇惊丸中的京尼平龙胆二糖苷、栀子苷、西红花苷-Ⅰ、去氢茯苓酸和茯苓酸的含量同时进行测定。样品处理方法简便，测定结果准确，适用于白益镇惊丸质量标准的提高。

1 仪器与试药

LC-20A型高效液相色谱仪（日本岛津公司，包括SIL-20A双元泵、SPD-M20A可变波长检测器、LC solution色谱工作站）；XS205DU电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；KQ-100DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

白益镇惊丸（每丸重1 g，批号：1501305、1501312、1601301，杭州胡庆余堂药业有限公司）；京尼平龙胆二糖苷对照品（批号：29307-60-6，含量98.0%，上海融禾医药科技发展有限公司）；去氢茯苓酸对照品（批号：77012-31-8，含量98.0%，上海科顺生物科技有限公司）、茯苓酸对照品（批号：29070-92-6，含量98.0%，上海科顺生物科技有限公司）；栀子苷对照品（批号：110749-201316，含量97.5%，使用前无需处理，中国食品药品检定研究院）、西红花苷-Ⅰ对照品（批号：111588-201303，含量92.6%，使用前无需处理，冷冻避光保存，中国食品药品检定研究院）。乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯，水为纯净水。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

采用Phenomene C18（250 mm×4.6 mm，5μm)色谱柱；流动相A：乙腈，流动相B：0.5%磷酸溶液，梯度洗脱^[2-5]（0~11 min，15.0%A；11~22 min，15.0%A→28.0%A；22~31 min，28.0%A→45.0%A；31~42 min，45.0%A→70.0%A；42~50 min，70.0%A→15.0%A）；0~22 min时在238 nm^[6-8]波长下检测京尼平龙胆二糖苷和栀子苷，22~31 min在440 nm^[9-10]波长下检测西红花苷-Ⅰ，31~50 min在210 nm^[11-12]波长下检测去氢茯苓酸和茯苓酸；流速：0.9 mL·min^-1；柱温：30 ℃；进样量为10 μL。

2.2 溶液的制备 2.2.1 混合对照品溶液

分别精密称取对照品京尼平龙胆二糖苷、栀子苷、西红花苷-Ⅰ、去氢茯苓酸和茯苓酸适量，用70%甲醇分别制成含京尼平龙胆二糖苷0.593mg·mL^-1、栀子苷1.141 mg·mL^-1、西红花苷-Ⅰ0.495 mg·mL^-1、去氢茯苓酸0.410 mg·mL^-1和茯苓酸0.478 mg·mL^-1的对照品储备溶液。

再分别依次量取上述各对照品储备液适量，置同一50 mL量瓶中，用70%甲醇制成含京尼平龙胆二糖苷0.0593 mg·mL ^-1、栀子苷0.1141mg·mL^-1、西红花苷-Ⅰ 0.0198 mg·mL^-1、去氢茯苓酸0.0123 mg·mL^-1、茯苓酸0.0239 mg·mL^-1的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液

取白益镇惊丸适量，研细，取约5.0 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加入70%甲醇约45 mL，超声（功率：100 W，频率：40 kHz）提取30 min，放冷，用70%甲醇加至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液

按白益镇惊丸的处方，分别制备不含栀子的阴性样品、不含茯苓的阴性样品，按“2.2.2”节方法制成相应的阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验

分别取上述2种阴性对照溶液、混合对照品溶液和供试品溶液，在上述色谱条件下，进行测定。试验结果显示，各阴性对照溶液的色谱图中，在京尼平龙胆二糖苷、栀子苷、西红花苷-Ⅰ、去氢茯苓酸和茯苓酸5种成分对应的位置上均无干扰，理论板数均大于2000。色谱图详见图 1。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取“2.2.1”节对照品储备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，各置10 mL量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成一系列浓度的混合对照品溶液。按照上述色谱条件，进行测定，采用质量浓度X作为横坐标，测得的峰面积Y作为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程，如表 1所示。

2.5 精密度试验

取“2.2.1”节混合对照品溶液，按“2.1”节色谱条件测定，连续进样6次，测定峰面积，结果京尼平龙胆二糖苷、栀子苷、西红花苷-Ⅰ、去氢茯苓酸和茯苓酸峰面积的RSD分别为0.92%、0.75%、1.02%、1.11%、1.08%，表明仪器具有良好的精密度。

2.6 稳定性试验

取批号1501305的白益镇惊丸的供试品溶液，于配制后在室温下放置0、2、4、6、8、12 h，按上述色谱条件，分别进样，每次进样量为10 μL，测定京尼平龙胆二糖苷、栀子苷、西红花苷-Ⅰ、去氢茯苓酸和茯苓酸的峰面积值，并求得京尼平龙胆二糖苷、栀子苷、西红花苷-Ⅰ、去氢茯苓酸和茯苓酸峰面积的RSD分别为0.88%、0.64%、1.01%、1.16%和1.07%。结果显示白益镇惊丸供试品溶液在室温下12 h内很稳定。

2.7 重复性试验

取批号1501305的白益镇惊丸样品6份，按“2.2.2”节方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下，进行测定，分别计算京尼平龙胆二糖苷、栀子苷、西红花苷-Ⅰ、去氢茯苓酸和茯苓酸的含量，并计算所测5种组分京尼平龙胆二糖苷、栀子苷、西红花苷-Ⅰ、去氢茯苓酸和茯苓酸含量的RSD依次为1.39%、1.24%、1.66%、1.84%和1.71%。结果表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的白益镇惊丸（批号：1501305）适量，研细，称定6份，每份约2.5 g，精密称定，置50 mL量瓶中，精密加入混合对照品溶液25 mL、70%甲醇20 mL，超声（功率：100 W，频率：40 kHz）提取30 min，放冷，用70%甲醇加至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，作为加样回收样品试液。按照上述色谱条件，进行测定，计算5种组分的回收率及RSD，结果见表 2~6。

2.9 样品的测定

取3批白益镇惊丸，按“2.2.2”节方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下，进样测定，结果见表 7。

3 讨论 3.1 测定波长和流动相的选择

采用京尼平龙胆二糖苷、栀子苷、西红花苷-Ⅰ、去氢茯苓酸和茯苓酸各对照品溶液进行全波长紫外扫描，最终确定京尼平龙胆二糖苷和栀子苷的检测波长为238 nm，西红花苷-Ⅰ的检测波长为440nm,去氢茯苓酸和茯苓酸的检测波长为210 nm。

在流动相的选择上，考察了乙腈-0.5%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液^[13]和乙腈-0.1%磷酸溶液的流动相体系, 由于该制剂含多种中药材，且各药材又含多种组分，为了使各组分之间更好地得到分离，综合考虑，最终选择乙腈-0.5%磷酸溶液为流动相体系。

3.2 流速的考察

分别对流动相流速（0.8、0.9、1.0 mL·min^-1）进行考察，以不同流速对各成分峰分离度及峰形的影响为指标，最终选择0.9 mL·min^-1作为定量测定流动相的流速。

3.3 提取方式及提取溶剂的选择

曾考察不同提取方式（加热回流、超声处理、索氏提取）及提取溶剂（甲醇^[14]、70%甲醇^[15]、40%甲醇）对样品所测各组分提取效果的影响，综合考虑所测各成分的提取率和操作的便捷性，最终确定提取方法为70%甲醇超声提取30 min。