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  中国药事   2019, Vol. 33 Issue (7): 813-818.  DOI: 10.16153/j.1002-7777.2019.07.015
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技术研究

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毕华, 李永红, 范文红, 陶磊, 裴德宁, 丁有学, 饶春明. 血管内皮生长因子抑制剂结合活性试验两种结果分析方法比较[J]. 中国药事, 2019, 33(7): 813-818. DOI: 10.16153/j.1002-7777.2019.07.015.
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Bi Hua, Li Yonghong, Fan Wenhong, Tao Lei, Pei Dening, Ding Youxue, Rao Chunming. Comparison of Two Methods for Analyzing the Results of Vascular Endothelial Growth Factor Inhibitors Binding Activity Assays[J]. Chinese Pharmaceutical Affairs, 2019, 33(7): 813-818. DOI: 10.16153/j.1002-7777.2019.07.015.
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作者简介

毕华, 副研究员, 研究方向:生物技术药物质量控制, Tel:(010)67095684, E-mail:bihua9418@126.com

通信作者

丁有学, E-mail:dingyouxue@nifdc.org.cn
饶春明, 研究员, E-mail:raocm@nifdc.org.cn

文章历史

收稿日期:2019-01-14
血管内皮生长因子抑制剂结合活性试验两种结果分析方法比较
毕华 , 李永红 , 范文红 , 陶磊 , 裴德宁 , 丁有学 , 饶春明     
中国食品药品检定研究院, 北京 100050
摘要目的:对血管内皮生长因子抑制剂(VEGF Trap)结合活性试验两种结果分析方法进行比较,以考察两者的差异。方法:采用固定剂量的VEGF与系列稀释的VEGF Trap处理之后,检测未结合的VEGF的量,分别以未结合的VEGF量对VEGF Trap浓度梯度和未结合的VEGF检测板的OD值对VEGF Trap浓度梯度进行四参数方程拟合,两种方法计算该产品的结合活性。结果:两种方法均满足试验有效性条件,且血管内皮生长因子抑制剂供试品和标准品的半数抑制浓度(IC50)均分别为3.68和3.6pmoL·L-1,供试品的结合活性为102%。结论:证明了两种分析方法得到的结果完全一致。为同类产品结合活性计算方法的选择提供借鉴。
关键词血管内皮生长因子抑制剂    结合活性    半数抑制浓度    四参数方程    
Comparison of Two Methods for Analyzing the Results of Vascular Endothelial Growth Factor Inhibitors Binding Activity Assays
Bi Hua , Li Yonghong , Fan Wenhong , Tao Lei , Pei Dening , Ding Youxue , Rao Chunming     
National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China
Abstract: Objective: To compare the two methods for analyzing the results of vascular endothelial growth factor inhibitors binding activity assays.Methods: After a fixed amount of VEGF was applied to serially dilute VEGF Trap, the amount of unbound VEGF was detected. The two methods were used to calculate the binding activity of the products. One was the four-parameter equation fitting of the concentration gradient of VEGF Trap with the unbound VEGF amount, and the other was the four-parameter equation fitting of the concentration gradient of VEGF Trap with the OD value of the unbound VEGF detection plate.Results: Both methods met the test validity conditions, and the half inhibitory concentration (IC50) of the vascular endothelial growth factor inhibitors' tested samples and the standard substance was 3.68 and 3.6 pmoL·L-1 respectively. The binding activity of the tested samples was 102%.Conclusion: The results obtained by the two methods are identical, which provide references for selecting methods for calculating the binding activity of similar products.
Keywords: vascular endothelial growth factor inhibitors    binding activity    half inhibitory concentration    fourparameter equation    

血管内皮生长因子抑制剂(VEGF Trap)是具有VEGF阻断作用的重组蛋白,由两种不同的人VEGF受体VEGFR1和VEGFR2的细胞外区域融合到人免疫球蛋白IgG1的Fc部分组成。对VEGF-A、VEGF-B和PlGF等因子有较好的亲和力。血管内皮生长因子抑制剂通过与上述因子的紧密结合,降低血管通透性,进一步抑制新生血管的生成。目前,该产品已经在美国、欧盟、日本及中国上市,主要用于治疗年龄相关性黄斑变性(Age Related Macular Degeneration,AMD)、视网膜静脉阻塞(Retinal Vein Occlusion,RVO)继发黄斑水肿,以及糖尿病黄斑水肿(Diabetic Macular Edema,DME)等[1-4]

前期已建立了VEGF Trap的质控方法和质控标准用于其质量控制[5-6]。其中结和力是VEGF Trap性能参数中一个重要的指标,是质量控制的关键[7-9],采用的方法是将固定量的VEGF与系列稀释的VEGF Trap处理之后,再检测未结合的VEGF的量,该法虽增加了预先结合的步骤,但下一步检测时采用商业化的试剂盒,干扰因素少,商业化抗体与被检抗体相互验证,结果更加真实、客观[10-11]

本研究比较了VEGF Trap结合活性试验中两种结果的分析方法,以考察两者之间的差异,为同类产品结合活性试验结果分析方法的选择提供借鉴。

1 材料与方法 1.1 试验材料及仪器

VEGF Trap标准品和一个批次的1支VEGF Trap供试品均为本科室留样;重组人VEGF165(货号293-VE)和Quantikine Human VEGF ELISA试剂盒(编号DVE00)均购自美国R&D Systems公司;BSA(编号12659)购自德国默克公司;脱脂奶粉(编号232100)购自美国BD公司;SpectraMax Gemini XS酶标仪及SOFT MAX分析软件为美国Molecular Devices公司产品。

1.2 结合试验酶标板的包被

在96孔酶标板每孔加入300 μL封闭剂(含0.1%BSA和5%脱脂奶粉的PBS溶液),于室温放置至少2 h,使用前用PBS洗涤4次。

1.3 供试品的制备

用稀释液(含0.1% BSA的PBS溶液)将VEGF Trap标准品和VEGF Trap供试品稀释至1 nmoL·L-1(其相对分子质量为97000);将VEGF165稀释至0.2nmoL·L-1(其相对分子质量为42000),在结合试验中作为固定量的VEGF165;将VEGF165稀释至1 nmoL·L-1,用于绘制标准曲线。另配制320 pmoL·L-1和48 pmoL·L-1的VEGF165溶液,用于质控。另取一块新的96孔酶标板作为稀释板,在该板中加入用稀释液制备好的1 nmoL·L-1 VEGF Trap供试品和标准品进行2倍系列稀释,共10个稀释度,同时设置空白对照孔,每个供试品做3个重复孔。

1.4 结合板的制备

取包被好的96孔酶标板作为结合板,将稀释好的VEGF Trap供试品和标准品25 μL加至该板的孔中,每孔再加入165 μL稀释液和10 μL的0.2nmoL·L-1的VEGF165溶液。混匀,室温下孵育12~20 h。

1.5 VEGF165标准曲线及质控孔的制备

用稀释液对1 nmoL·L-1的重组人VEGF165进行2倍系列稀释,共7个稀释度,同时设空白对照孔。取稀释好的上述溶液10 μL,加至结合板的孔中,每孔加入190 μL稀释液,用作VEGF165标准曲线制备。在结合板的新孔中再分别加入320和48 pmoL·L-1的VEGF165溶液25 μL,再向各孔中加入175 μL稀释液,制得40和6 pmoL·L-1的VEGF165溶液,作为试验中VEGF165溶液高浓度和低浓度质控孔。混匀,室温下孵育12~20 h。

1.6 游离VEGF165的检测

从结合板中取出100 μ L结合液,加入Quantikine® Human VEGF检测板中,采用双抗体夹心ELISA法,按试剂盒说明书检测结合后游离VEGF165

1.7 结果分析方法 1.7.1 方法一

使用Molecular Devices酶标仪,在450 nm处测定VEGF165检测板各孔的A值。根据VEGF165的标准曲线计算VEGF Trap供试品和标准品各浓度梯度下未结合的VEGF165的量。然后以VEGF Trap供试品及标准品浓度的对数值为横坐标,对应的VEGF165含量值为纵坐标,进行四参数方程曲线拟合。计算供试品和标准品的半数抑制浓度(IC50),按照公式:结合活性(%)=供试品的IC50/标准品的IC50×100%,计算出供试品的结合活性。

1.7.2 方法二

使用Molecular Devices酶标仪,在450 nm处测定VEGF165检测板各孔的OD值。以VEGF Trap标准品及供试品浓度的对数值为横坐标,OD450值为纵坐标,进行四参数方程曲线拟合。计算标准品和供试品的半数抑制浓度(IC50),按照公式:相对结合力(%)=供试品的IC50/标准品的IC50× 100%,计算出供试品的结合活性。

1.8 试验有效性

VEGF标准曲线线性回归分析R2值必须不低于0.98;40 pmoL·L-1VEGF165质控的3个重复孔中,应有2个在28~52 pmoL·L-1;6 pmoL·L-1 VEGF165质控的3个重复孔中,应有2个4~9 pmoL·L-1。标准品与供试品结合曲线的非线性回归分析R2值必须不低于0.98;标准品的IC50值必须在2~5 pmoL·L-1。只有同时满足上述条件时,才视为试验有效。按下式计算VEGF Trap的相对结合力,65%~135%为合格。

2 结果 2.1 方法一

在450 nm下测定结合板每一个孔的吸光度值。根据VEGF165标准品的浓度值及吸光度值绘制VEGF165标准曲线,分别计算出质控点VEGF Trap供试品和标准品各浓度梯度下未结合的VEGF165的量,结果如表 1表 2所示。

表 1 VEGF Trap标准品各浓度梯度下未结合的VEGF165的量

表 2 VEGF Trap供试品各浓度梯度下未结合的VEGF165的量

VEGF165标准曲线线性回归方程:Y=0.081+0.028xR2值为0.999,曲线如图 1所示;VEGF165标准品各个浓度与吸光度值的对应关系如表 3所示;40 pmoL·L-1VEGF165质控的3个重复孔值分别为46.12、46.31、43.66 pmoL·L-1;6 pmoL·L-1 VEGF165质控的3个重复孔值分别为5.32、5.69、6.10 pmoL·L-1。以VEGF Trap供试品及标准品浓度的对数值为横坐标,对应的VEGF165含量值为纵坐标,进行四参数方程曲线拟合,分别绘制供试品和标准品的曲线,求出供试品和标准品的半数抑制浓度分别为3.68和3.6 pmoL·L-1,标准品与供试品结合曲线的非线性回归分析方程:Y=9.961/(1+x/3.68)2.11+0.639,R2值为0.997,如图 2所示。以上均满足该试验的有效性条件,所以试验有效。计算供试品的结合活性为102%。

图 1 VEGF165标准曲线

表 3 VEGF165标准品浓度及吸光度值

图 2 未结合的VEGF165与VEGF Trap浓度对应关系曲线
2.2 方法二

在450 nm直接测定VEGF165检测板各孔的吸光度值。直接以VEGF Trap标准品及供试品浓度的对数值为横坐标,OD450值为纵坐标,进行四参数方程曲线拟合,曲线如图 3所示。标准品与供试品结合曲线的非线性回归分析的R2值分别为0.997。回归方程:y=0.2771/(1+x/3.68)2.11+0.0989。计算供试品和标准品的半数抑制浓度(IC50)分别为3.68和3.6 pmoL·L-1,VEGF165标准曲线和各个质控孔的值同上。均满足试验有效性条件,计算供试品的结合活性为102%。

图 3 未结合的VEGF165吸光度值与VEGF Trap浓度对应关系
3 讨论

经过两种方法的对比表明,以VEGF Trap标准品及供试品浓度的对数值为横坐标,以未结合的VEGF165的量值或直接以未结合的VEGF165的吸光度值为纵坐标,计算得到的VEGF Trap的结合活性一致。

结合活性的计算方法为待测供试品与标准品IC50(半数抑制浓度)之比,而半数抑制浓度为纵坐标是S形曲线上下渐近线差值中点时,横坐标所表示的值,即其所对应的VEGF Trap浓度;理论上,无论以未结合的VEGF165的量值或直接以未结合的VEGF165的吸光度值为纵坐标,两者所得到的横坐标即对应的VEGF Trap浓度一致,纵坐标VEGF165的量值或未结合的VEGF165的吸光度值本身存在着一定的y=kx+b的直线关系,计算半数抑制浓度时,利用了上下渐近线的差值,使得b值被消除,所以方法一和方法二得到的曲线实际上只是纵坐标被放大了k倍,而对应的横坐标相同,这是两种方法得到相同的结合活性的理论依据。

本研究中,方法二计算上操作简便,不用再将VEGF165的OD值转换成VEGF165的含量值;方法一,虽然要经过计算未结合的VEGF165这一步骤,但转换后四参数的图形的纵坐标变大,且直接以未结合的VEGF165的量来表示更加直观。目前,SoftMax公司有专门的软件GXP,能够通过OD值直接转换成VEGF165的含量值,并绘制VEGF165的含量值对VEGF Trap浓度的四参数曲线,十分方便,但需单独购买该软件,需要一定的成本。

本研究比较了用于VEGF Trap结合力试验的两种计算方法,结果表明,两种方法结果一致,在实践中具体采用哪种方法,可根据实际情况而定。

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