西藏棱子芹是藏医临床常用的传统药材, 其藏文译音为"尕傻""赞扎", 为二十五味儿茶丸、五根散和六味枸杞糖浆等常用藏药成方制剂中的重要组成药味, 主要分布于西藏、四川、云南、青海、甘肃等地, 生长在海拔3500~5300 m的山坡草地或河滩灌丛处^[1-3]。《中华藏本草》^[2]、《西藏经济植物志》^[3]和《藏药志》^[4]记载西藏棱子芹以根入药, 具有滋补脾胃、健肾的作用, 用于治疗肾炎、肾寒腰痛、消化不良、黄水病等症。而《中国中药资源志要》^[5]及《中国藏药》^[6]记载西藏棱子芹以干燥全草入药, 前者^[2-4]记载功效为味辛、性温, 具有理气活血止痛的作用, 而后者^[5-6]记载的功效为性凉、味苦, 具有清热解毒的作用。

经查阅诸多藏医药史书典籍, 发现文献中记载西藏棱子芹的品种多、较混乱, 存在同名异物、同物异名、用药部位和临床功效各异的情况, 使藏医的临床用药难以统一。为了保证藏药的安全、有效、质量可控, 本研究对西藏棱子芹的基原进行考证, 并通过植物形态特征、组织粉末显微鉴定等生药鉴别手段和薄层鉴别、常规检查及含量测定等化学测定手段来全面地控制本品质量, 为藏医药的资源开发和利用提供依据。

1 仪器与试药

TSWview显微照相机; ECLIPSEE100光学显微镜(尼康仪器有限公司); IRD-7080型鼓风干燥箱(上海智诚分析仪器制造有限公司); AS3120型超声波处理器(AUTO SCIENCE公司); HWS24型电热恒温水浴锅(上海一恒科技仪器有限公司); XP205DR十万分之一电子天平(METTLER TOLEDO公司); 水为纯化水(自制); 试剂均为分析纯。

6批棱子芹药材收集于西藏拉萨、林芝、昌都, 以及四川阿坝藏族自治州和青海西宁等地, 经四川大学华西药学院生药系王曙教授鉴定为伞形科植物西藏棱子芹Pleurospermum hookeri C.B.Clarke var. thomsonii C.B.Clarke的干燥根及根茎, 样品收集信息见表 1。

2 方法与结果 2.1 基原考证

西藏棱子芹文献记载的基原较为混乱:《中华藏本草》^[2]和《晶珠本草》^[7]中记载为伞形科植物西藏棱子芹Pleurospermum tibetanicum Wolff的根; 部颁标准藏药分册^[8]中记载西藏棱子芹为伞形科植物西藏棱子芹Pleurospermum tibetanicum (Turcz.) Schischk.或迷果芹Sphallerocarpus gracillis (Bess)K.-Pol.的干燥根。而《西藏经济植物志》^[3]、《藏药志》^[4]、《中国藏药》^[6]、中国数字植物标本馆^[9]和《迪庆藏药》^[10]中记载西藏棱子芹的拉丁学名为Pleurospermum hookeri C.B.Clarke var. thomsonii C.B.Clarke.。通过对西藏地区的藏药厂、药材市场、药检所和四川藏族阿坝自治州的藏医临床应用走访调查发现, 藏族地区很少使用迷果芹。迷果芹主要分布在中国的东北部及远东地区, 吉林、辽宁、新疆、蒙古等, 一般以全草入药, 用于治疗风湿性关节炎等症^[11], 这与部颁标准藏药分册中记载的药用部位和临床功效不一致。同时, 通过对西藏、四川和青海等地采集的原植物标本及购买西藏棱子芹药材商品的物种鉴定, 确认西藏棱子芹为伞形科植物西藏棱子芹Pleurospermum hookeri C.B.clarke var. thomsonii C.B.Clarke。《中华藏本草》^[2]和《晶珠本草》^[7]记载的西藏棱子芹Pleurospermum tibetanicum Wolff与《西藏经济植物志》^[3]、《藏药志》^[4]、《中国藏药》^[6]、中国数字植物标本馆^[9]和《迪庆藏药》^[10]中记载的西藏棱子芹Pleurospermum hookeri C.B.clarke var. thomsonii C.B.Clarke是同一植物, 只是拉丁学名考证有误, 即出现了同物异名的情况。

2.2 植物形态

西藏棱子芹原植物为多年生草本, 高20~ 100 cm, 全体无毛。根呈长圆锥形, 细长或较粗壮, 棕褐色或黄褐色, 直径0.5~4 cm。茎直立, 单一或数茎丛生, 圆柱形, 有条棱; 基生叶多数呈三角状卵形, 叶柄长10~28 cm, 叶柄基部有宽阔的叶鞘抱茎; 茎生叶轮廓三角形, 2~3回羽状分裂, 羽片7~9对, 一回羽片披针形或卵状披针形, 最下一对羽片有明显的柄, 向上逐渐变短, 羽片长达3~5 cm, 宽1.5~2.5 cm, 末回裂片卵形或宽楔形, 长宽各5 mm左右, 羽片深裂呈线形小裂片; 茎上部的叶少数, 简化, 叶柄常常只有膜质的鞘状部分。复伞形花序顶生, 直径5~7 cm; 总苞片5~7枚, 披针形或线状披针形, 长1.0~2.5 cm, 顶端长尖或羽状分裂, 边缘有淡褐色或白色透明膜质, 花盛开时常脱落; 伞幅6~13 cm, 长2~4 cm, 有条棱; 小总苞片7~9枚, 线状披针形, 长3~6 mm, 略比花长; 花多数, 花柄长3~6 mm, 扁平; 花白色或有些花瓣稍带紫红色, 花瓣倒卵形或近圆形, 直径1.0~1.5 mm, 复伞形花序最外轮花瓣显著增大, 顶端有内曲的小舌片, 基部有短爪; 萼齿明显, 狭三角形, 长约1 mm; 花药暗紫色; 分果呈卵圆形, 长3~4 mm, 果棱有狭翅, 每棱槽有油管3条, 合生面有油管6条。花期7~8月, 果期9~10月(见图 1)。

2.3 性状

根呈长圆锥形, 常单枝, 也有2~4分枝, 长4~20 cm, 直径4~22 mm。表面灰棕色或黄褐色, 近根头部有横皱纹, 渐至下部有不规则纵皱纹, 并有多数横长皮孔痕和点状根痕, 根头部常带有残留茎基。质硬脆, 断面黄白色, 皮部占大部分, 有多数裂隙, 形成层明显, 木质部灰褐色, 气微香, 特异, 味微甜(见图 2)。

2.4 显微鉴别 2.4.1 根横切面

木栓层由数列木栓细胞组成, 呈长方形, 排列整齐; 皮层和韧皮部约占横切面的1/2, 多裂隙。皮层菲薄, 呈切向延长, 稀疏分布有分泌腔(油室); 韧皮部宽广, 含多数分泌腔, 分泌腔近形成层处渐小, 呈类圆形, 直径20~60 μm, 周围分泌细胞5~8个, 内含黄棕色油脂状物质; 形成层环状, 由3~5列细胞组成; 木质部导管单个或数个成束状, 呈放射状排列; 木射线宽至3~8列细胞, 细胞类多角形(见图 3)。

2.4.2 根茎横切面

皮层和韧皮部约占横切面的1/3, 多裂隙, 分布有多数分泌腔, 髓部明显, 约占横切面的1/5, 少见分泌腔散在, 其余与根类似(见图 3)。

2.4.3 粉末特征

本品粉末为灰棕色。薄壁细胞长方形或类多角形, 垂周壁略水波状, 直径25~200 μm; 油管多碎断, 分泌细胞大多狭长, 管道中含有黄棕色条状分泌物, 周围薄壁细胞界限不明显; 木栓细胞棕褐色, 表面观类多角形, 壁稍厚; 导管为网纹、梯纹及螺纹导管, 直径25~150 μm; 淀粉粒类圆形, 单粒或复粒(见图 4)。

2.5 薄层鉴别 2.5.1 供试品溶液的制备

取药材粉末(过3号筛)0.5 g, 加无水乙醇20 mL超声(功率150 kW, 频率40 kHz)处理30 min, 滤过, 滤液蒸干, 残渣用无水乙醇溶解2 mL, 作为供试品溶液。

2.5.2 对照药材溶液的制备

取西藏棱子芹对照药材0.5 g, 按"2.5.1"节方法制成对照药材溶液。

2.5.3 薄层色谱条件及样品检视

照薄层色谱法《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2015年版四部通则0502^[12]试验, 吸取上述两种溶液各10 μL, 分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶GF₂₅₄薄层板上, 以正己烷-乙酸乙酯(8:2)为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中, 在与对照药材色谱相应的位置上, 显相同颜色的斑点。按上述条件对6批药材进行薄层鉴别, 结果均能检出特征成分, 斑点清晰, 分离度较好(见图 5)。

2.6 检查 2.6.1 水分测定

取西藏棱子芹药材粉末(过3号筛)约2 g, 精密称定, 照《中国药典》(2015年版四部通则0832第二法)进行水分测定^[12], 见表 2。

2.6.2 总灰分和酸不溶灰分测定

取西藏棱子芹药材粉末(过3号筛)约2 g, 精密称定, 照《中国药典》(2015年版四部通则2302)进行总灰分测定^[12], 见表 2。

2.6.3 浸出物测定

取西藏棱子芹药材粉末(过3号筛)约2 g, 精密称定, 照醇溶性浸出物测定法《中国药典》 (2015年版四部通则2201)热浸法测定, 用乙醇作溶剂^[12], 见表 2。

2.7 含量测定 2.7.1 药材粒度和提取时间的考察

以挥发油得率及挥发油提取完全的时间为指标, 将西藏棱子芹药材按最粗粉、粗粉、细粉3个水平进行单因素考察, 分别称取3种粒度的药材各120 g, 加入8倍量水, 浸泡1 h, 采用《中国药典》 (2015年版四部通则2204)^[12]挥发油测定甲法进行试验, 并记录不同提取时间的挥发油量, 计算挥发油得率。结果, 随着粉碎粒度的降低, 粉末在水中易糊化, 溶出效果降低, 药液中杂质多, 挥发油的收率下降; 随着提取时间的延长, 提取6 h和7 h的收率基本不变, 说明最粗粉在6 h基本提取完全。综合上述条件, 确定用药材最粗粉提取挥发油, 提取时间为6 h, 见表 3。

2.7.2 浸泡时间的考察

称取西藏棱子芹药材的最粗粉4份, 每份120 g, 加水8倍量, 分别浸泡0、1、2、4 h, 照"2.7.1"节下挥发油测定方法进行提取, 时间为6 h, 提取完成后读数, 计算挥发油得率。结果药材浸泡时间对挥发油收率的影响不显著, 当浸泡时间为1 h和4 h时, 挥发油含量最高, 从提取的效率考虑, 选用浸泡时间为1 h, 见表 4。

2.7.3 加水量的考察

称取西藏棱子芹药材的最粗粉4份, 每份120 g, 浸泡1 h, 分别加入4、6、8、10倍量水, 照"2.7.1"节下挥发油测定方法进行提取, 时间为6 h, 提取完成后读数, 计算挥发油得率。结果加水量在8倍时, 挥发油收率较高, 见表 5。

2.7.4 验证试验及含量测定

按照上述最佳工艺参数, 即加入8倍量水, 浸泡1 h, 挥发油提取时间为6 h, 分别对不同批次的西藏棱子芹药材进行测定, 并计算收率, 见表 6。

3 讨论 3.1 浸出物的考察

参照《中国药典》(2015年版四部通则2201)^[12]浸出物测定方法, 以乙醇为提取溶剂, 考察了冷浸法和热浸法对提取效率的影响, 结果热浸法的含量较高; 还分别考察了不同浓度乙醇(30%、50%、70%、95%)对浸出物的影响, 结果以50%乙醇(稀乙醇)为溶剂时浸出物含量较高。

3.2 薄层条件的考察

王曙等^[13]采用乙醚提取石榴日轮丸中西藏棱子芹的有效成分, 硅胶G薄层板, 展开剂为三氯甲烷-正己烷-乙酸乙酯(7:12:3), 在365 nm下观察; 杨凤梅等^[14]采用80%甲醇提取五根散中西藏棱子芹的有效成分, 硅胶G薄层板, 展开剂为甲醇-水-甲酸(8:2:1), 喷1%三氯化铝溶液后在365 nm下观察, 结果西藏棱子芹的特征斑点在上述条件制备的样品分离度不好。经过对制备条件和展开系统的优化, 最终本研究确定以无水乙醇提取, 硅胶GF₂₅₄薄层板, 正己烷-乙酸乙酯(8:2)为展开剂时样品的分离度更好, 斑点清晰。

3.3 限度指标的确定

本研究收集的6批西藏棱子芹来自西藏、四川和青海地区的藏药企业及药材市场, 样品具有一定的代表性。根据测定结果, 参照《中国药典》中药质量标准研究制定技术要求, 建议西藏棱子芹的水分检查不得过12%, 总灰分不得过8%, 酸不溶性灰分不得过1%;照醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定, 用50%乙醇作溶剂, 不得少于30%;本品挥发油含量不得少于0.3%。

3.4 研究进展

目前, 国内外报道的西藏棱子芹化学成分几乎为空白, 《藏药志》^[4]中记载:藏药"加哇"来源于6个不同属的植物, 现已报道的藏药加哇的其中一个来源属为西藏棱子芹, 即可能含有挥发油、黄酮、有机酸、甾醇类等的化学成分。王天志等^[15]采用提取分离纯化方法从加哇中分得10种化学成分, 分别是黄酮类、有机酸类和甾醇类的成分。李涛等^[16]采用HPLC法测定加哇中的甘草查耳酮甲、川陈皮素、异甘草素和阿魏酸含量。曹莺等^[17]采用GC-MS对西藏棱子芹的挥发油成分进行研究, 共鉴别出28种化学成分, 占挥发油总含量的82.21%, 鉴定出的主要为脂肪酸类、烷烃类、酯类、醛类和萜类等。袁明等^[18]还对西藏棱子芹的药理作用进行研究, 结果表明西藏棱子芹的水提物、醇提物对急慢性炎症均有良好的抗炎作用, 既可抑制炎症早期的水肿, 又可抑制炎症晚期的肉芽组织形成, 有效阻止炎症反应期的胶原和黏多糖在炎症部位的蓄积, 减轻肿胀和渗出等局部炎症反应。

本研究对西藏棱子芹进行了基原考证和系统的生药学研究, 纠正了现有文献^[17-20]对其基原确定错误的问题。由于西藏棱子芹化学成分不清, 因此含量测定项仅对挥发油进行了质量控制, 今后还将对其药理功效和基础成分进行探索, 希望对民族药西藏棱子芹的研究开发提供一些参考。