甘草为豆科植物甘草、胀果甘草或者光果甘草的干燥根及根茎，具有补脾益气、清热解毒、调和诸药的功效^[1]，现代研究发现甘草中含有大量的甘草皂苷、黄酮、多糖成分，药理试验发现甘草中的黄酮成分具有抗炎、抗变态反应的作用，其总皂苷具有调节淋巴细胞数量和活性、抗衰老、美白的功效^[2-5]。

酪氨酸酶是体内存在的一种氧化酶，其活性是黑色素形成的关键，也是影响皮肤颜色深浅的内在重要因素，它参与黑色素形成的多个环节，主要包括催化酪氨酸转化为多巴，再催化多巴形成多巴醌，继续催化后形成黑色素^[6-8]。甘草皂苷具有美白作用，但是皂苷分子量大，不易被人体吸收，因此采用体外生物转化的作用实现皂苷的体外水解。本试验采用3种不同方法进行体外生物转化，并进行抑制酪氨酸酶活性试验。

1 试验材料与仪器

KQ-500B型超声仪(昆山市超声仪器有限公司)；AB-135S型十万分之一电子分析天平(瑞士酶特勒-托利多公司)；DZKW-D-4型水浴锅(上海仪器仪表有限公司)；UV-1100型紫外-可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)。

甘草苷对照品(批号：111451-201507)，甘草酸铵对照品(批号：111739-201501)，对照品均来自中国食品药品检定研究院；L-多巴(批号：B21710)，酪氨酸酶(蘑菇，活力500 U·mg^-1，批号：D900202)，维生素C(批号：B21293)，均购自上海源叶生物科技有限公司；10000 U·mL^-1β-葡糖苷酶(来源于黑曲霉，批号：S24786，购自上海源叶生物科技有限公司)；蜗牛酶(批号：S10083，购自上海源叶生物科技有限公司)；高活性干酵母菌粉(安琪酵母股份有限公司)；乙腈(色谱纯)，磷酸氢二钠，柠檬酸；娃哈哈纯净水；蒸馏水。

2 试验方法与结果 2.1 试验方法 2.1.1 甘草总皂苷制备

称取甘草药材100 g，加水10倍量，煎煮两次，每次1 h；过滤；合并滤液。浓缩至相对密度为1.05~1.10；加无水乙醇至70%，放置12 h；高速离心(5000 r·min^-1)5 min；上清液回收乙醇至无醇味。然后采用D101(预先处理好)进行分离，上样完成后，依次采用去离子水、30%乙醇、70%乙醇过量洗脱；收集70%乙醇洗脱部位，减压回收乙醇至无醇味；再采用正丁醇饱和水溶液对洗脱部位进行萃取，收集正丁醇液；冷冻干燥，经测定，甘草总皂苷含量达到51.8%。

2.1.2 生物转化试验

蜗牛酶转化试验：取“2.1.1”节下的甘草总皂苷粉末200 mg，加pH 7.1的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，40℃恒温培养箱内放置30 min，再加入30 mg蜗牛酶，继续培养6 h，时时振荡，取出。采用0.45 μm滤膜过滤制备供试样品1。

酵母菌转化试验：取“2.1.1”节下的甘草总皂苷粉末200 mg置于锥形瓶中，加pH7.1的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液50 mL，再加入体积分数1.5%的干性酵母菌粉，置40℃恒温培养箱中，保温发酵6 h，并时时振摇，发酵结束后用蒸馏水补足失重，置85℃水浴10 min灭菌，4500 r·min^-1离心5 min；滤液蒸干，采用10 mL去离子水溶解，制备供试样品2。

黑曲霉转化试验：精密称取甘草总皂苷粉末200 mg置于锥形瓶中，加入适量pH 7.1的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，再加入1000 U活力的黑曲霉β-葡萄糖苷酶液，并补加缓冲溶液至反应体积为20 mL，置50℃恒温水浴锅中，保温酶解6 h，并时时振摇，滤液蒸干，采用10 mL去离子水溶解，制备供试样品3。

2.1.3 生物转化试验测定 2.1.3.1 HPLC测定方法

色谱柱：kromasiol-C18硅胶色谱柱；柱温：30℃；检测波长：237 nm；流动相：以乙腈为流动相A，以0.05%磷酸溶液为流动相B，按表 1中的规定进行梯度洗脱。

混合对照品溶液制备：取甘草苷对照品、甘草苷铵对照品适量，精密称定，加70%乙醇分别制成每1 mL含甘草苷20 μg、甘草苷铵0.2 mg的溶液。

2.1.3.2 标准曲线绘制

精密吸取混合对照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，依次注入高效液相色谱仪，按“2.1.3.1”节下色谱条件进行测定，分别以甘草苷D、甘草酸铵对照品的进样量(μg)为横坐标(X)，对应峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归(结果见表 3、表 4、图 1、图 2)。

2.1.3.3 样品测定

分别取混合对照溶液、供试样品1、供试样品2、供试样品3各10 μL，注入高效液相色谱仪，分别测定转化结果。

2.1.4 抑制酪氨酸酶试验 2.1.4.1 试剂制备

pH 6.8的PBS缓冲溶液：A液，每1 L蒸馏水中含NaH₂PO₄·2H₂O 7.80 g；B液，每1 L蒸馏水中含Na₂HPO₄·12H₂O 17.80 g；将A液、B液灭菌后冷藏保存，临用时取等体积混合，调pH值为6.8，即得。

酪氨酸酶溶液：精密称取酪氨酸酶11.30 mg，置25 mL棕色容量瓶中，用pH 6.8的PBS缓冲溶液定容至刻度，制备得226 U·mL^-1的酪氨酸酶溶液。

L-多巴溶液：精密称取L-多巴25.41 mg，置25 mL棕色容量瓶中，用pH 6.8的PBS缓冲溶液定容至刻度，制备得1.02 mg·mL^-1的L-多巴溶液。

2.1.4.2 供试样品溶液制备

维生素C阳性对照溶液：精密称取2.546 mg的维生素C置25 mL棕色容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，制备成0.102 mg·mL^-1的维生素C储备液，并稀释成0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08 mg·mL^-1不同浓度的维生素C阳性对照溶液，避光保存，备用。

甘草总皂苷溶液：称取甘草总皂苷20 mg左右，用pH 6.8的PBS缓冲溶液定容至10 mL容量瓶中，混匀，即得。

酶解液样品溶液：精密量取“2.1.2”节下酶解液20 mL，置85℃水浴保温10 min，杀酶后进行冷冻干燥，再用pH 6.8的PBS缓冲溶液定容至10 mL容量瓶中，再取出1.5 mL用PBS缓冲溶液定容至另一10 mL容量瓶中，混匀，即得。

2.1.4.3 抑制酪氨酸酶活性测定方法

吸取“2.1.4.2”节下配制的一系列浓度的维生素C阳性对照溶液和供试样品溶液，按表 2方法加入反应试管中，得到C1、C2、T1、T2 4组反应溶液，每组设定3组平行试验，先置30℃水浴保温反应20 min，再将4组反应溶液混匀，每组各自加入0.5 mL L-多巴溶液，混匀后继续置30 ℃水浴保温反应20 min，计时反应结束后立即用分光光度计于475 nm处测定各样品反应溶液的吸光度值，记为AC1、AC2、AT1、AT2。

酪氨酸酶抑制率计算公式：

$ 酪氨酸酶抑制率\% = \left( {1 - \frac{{{A_{\rm T1}} - {A_{\rm T2}}}}{{{A_{\rm C1}} - {A_{\rm C2}}}}} \right) \times 100\% $

式中：A_T1-A_T2，样品溶液吸光度值改变；

A_C1-A_C2，空白对照吸光度值改变。

按照以上测定方法吸取供试样品溶液进行测定，得各组样品吸光度值后，计算各供试样品酪氨酸酶抑制率，以酪氨酸酶抑制率均值为纵坐标，样品溶液浓度为横坐标，得维生素C抑制酪氨酸酶活性曲线。

2.2 试验结果 2.2.1 标准曲线结果

标准曲线结果如表 3、表 4、图 1、图 2所示。

试验结果得出甘草苷及甘草次酸的回归方程分别为：Y=2926525.09X+1632.2(r=0.99996)，Y=659561X+33746(r=0.99998)，结果表明甘草苷和甘草酸铵分别在0.4920~9.8400 μg、0.4520~9.0400 μg范围内线性关系良好。

2.2.2 生物转化测定结果

将甘草苷、甘草酸铵混合对照溶液注入高效液相仪中，结果如图 3所示。

通过计算得出2个对照品分离度大于2.0，塔板数大于5000。

按照“2.1.3.1”液相测定方法对各样品进行测定；结果如图 4、图 5、图 6、表 5所示。

观察图 3、图 4、图 5、图 6得出，与甘草混合对照品溶液比较，蜗牛酶、黑曲霉下的样品在68.13~71.48 min之间出现了甘草酸铵峰，结合表 5得出蜗牛酶、黑曲霉作用后的样品甘草苷峰面积下降，计算得出两者的转化率分别为28.14%、36.72%。而经酵母菌发酵转化后测定甘草苷含量没有明显变化，说明酵母菌粉并不能水解甘草苷，甘草苷也没有发生转化反应。

2.2.3 抑制酪氨酸酶活性试验结果 2.2.3.1 维生素C抑制酪氨酸酶活性结果

按照“2.1.4.2”节下方法进行试验，得出维生素C抑制酪氨酸酶活性曲线。结果如表 6、图 7所示。

结果表明，在试验浓度范围内，维生素C对酪氨酸酶抑制率的趋势为先随维生素C浓度的增大而增大，抑制率达到最高值后则不再随样品浓度的增大而变化，运用SPSS17.0统计软件分析可知，半抑制率IC₅₀为0.073 mg·mL^-1。

2.2.3.2 生物转化样品抑制酪氨酸酶活性结果

对供试样品1、2、3和甘草总皂苷样品分别进行抑制酪氨酸酶试验，结果如表 7、图 8所示。

抑制率测定结果表明：各样品中蜗牛酶解液、酵母菌发酵液、黑曲霉发酵液对酪氨酸酶活性抑制作用基本没有或较弱，而甘草总皂苷抑制率为50.67%，有较好的抑制酪氨酸酶活性的作用，说明不同方法酶解后，甘草总皂苷抑制酪氨酸酶活性的作用受到严重弱化，单从抑制酪氨酸酶活性考虑，不宜采取上述酶解方法进行酶解。

3 讨论

试验分别采用蜗牛酶、酵母菌、黑曲霉3种媒介对甘草总皂苷溶液进行体外生物转化，结果发现采用蜗牛酶、黑曲霉可以实现甘草苷的部分转化，但是酵母菌不能使甘草苷转化为甘草酸铵。说明酵母菌作为真菌并不具备转化甘草苷作用。蜗牛酶、黑曲霉作为多糖苷酶来源可以使甘草苷的糖苷键断裂实现转化目的。

结合抑制酪氨酸酶活性试验得出，3种不同处理方法处理后的样品在抑制酪氨酸酶活性上存在一定差异。甘草总皂苷溶液抑制酪氨酸酶活性要强于3种转化溶液，而且酵母菌处理后的溶液活性也优于其他两个样品。

结合本试验结果，后期研究需要进行两方面试验：首先，测定甘草苷纯品与甘草总皂苷之间对于酪氨酸酶活性抑制的差异；其次，研究不同浓度的甘草总皂苷溶液对于酪氨酸酶活性抑制的差异，充分研究其作用机理，为后期甘草类化妆品开发奠定理论基础。