冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordyceps sinensis（BerK.）Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体，主要分布在我国青海、西藏、甘肃、云南和四川等高海拔地区，是传统的名贵中药材，在中国有悠久的药用历史，具有补肾益肺、止血化痰的功效^[1-3]。近年来，冬虫夏草的人工繁育技术获得突破，为冬虫夏草稀缺野生资源的可持续发展提供了一条途径^[4]。冬虫夏草主要含有核苷、多糖、多肽、甾醇、氨基酸等多种化学成分^[5-10]。以腺苷为代表的核苷类大极性水溶性成分已经有较多研究报道^[11-13]。麦角甾醇是真菌类的特征甾醇，是冬虫夏草的重要活性成分之一，为脂溶性维生素D2的前体，具有抗癌、防衰老、减毒等功效^[14]。本实验以麦角甾醇为对照品，以凉山虫草为参照，建立冬虫夏草人工繁育品与野生品基于甾醇的特征图谱，同时测定麦角甾醇的含量，并进行比较研究。

1 仪器和材料 1.1 仪器

Waters H-Class型超高效液相色谱仪（沃特世公司），二极管阵列检测器（沃特世公司），Sartorius QUINTIX313-1CN型万分之一电子天平（Sartorius公司），Sartorius MSE125s型十万分之一电子天平（Sartorius公司）。

1.2 试药

麦角甾醇对照品（中国食品药品检定研究院，批号111845-201403，纯度95.5%）。甲醇为色谱纯（Fisher公司），水为Milli-Q超纯水。色谱柱XBridge C18柱（填料：十八烷基键合硅胶，2.1 mm×100 mm，1.6 µm；Waters仪器公司）。

1.3 药材

野生冬虫夏草17批次（样品编号：1~17），采自于西藏自治区、青海省、四川省、甘肃省、云南省；冬虫夏草人工繁育品10批次（样品编号：18~27），由广东东阳光药业有限公司提供；凉山虫草5批次（样品编号：28~32），采自四川省凉山彝族自治州。

冬虫夏草人工繁育品和野生品均经中国食品药品检定研究院中药民族药检定所郑健研究员鉴定为麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordyceps sinensis（BerK.）Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体。凉山虫草为麦角菌科真菌凉山虫草Cordyceps liangshanensis Zeng. Liu et HuGray寄生在鳞翅目昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体。

2 溶液的制备 2.1 对照品溶液的制备

取麦角甾醇对照品约10 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解配制成约1 mg·mL^-1的对照品储备溶液；再加甲醇稀释成约100 µg·mL^-1的溶液，用0.22 µm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2 供试品溶液的制备

取样品粉末（过四号筛）约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率33 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22 µm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

3 色谱条件

色谱柱：Waters XBridge C18柱（2.1 mm×100 mm，1.6 µm）；流动相：甲醇-水（95：5）；检测波长：282 nm；流速：0.3 mL·min^-1；柱温：30 ℃；进样量：1 µL。

4 特征图谱 4.1 精密度试验

精密吸取同一野生冬虫夏草供试品溶液（样品1）1 µL，按上述色谱条件连续进样测定6次，记录色谱图。以麦角甾醇参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积。结果各特征峰相对保留时间的RSD＜1%，单峰面积占总峰面积大于2%特征峰的相对峰面积RSD＜2%，采用科迈恩（北京）科技有限公司Chempattern化学计量学软件进行评价，相似度（夹角余弦法计算，下同）为0.99，结果表明仪器精密度良好。

4.2 稳定性试验

精密吸取同一野生冬虫夏草供试品溶液（样品1）1 µL，分别于0、2、4、6、8、12、24 h按上述色谱条件进样测定，记录色谱图。以麦角甾醇为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积。结果各特征峰相对保留时间的RSD＜1%，单峰面积占总峰面积大于2%特征峰的相对峰面积RSD＜2%，采用Chempattern化学计量学软件进行评价，相似度为0.99，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

4.3 重复性试验

取同一野生冬虫夏草供试品溶液（样品1）6份，精密称定，按“2.2”节下方法分别制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 µL，分别进样测定，记录色谱图。以麦角甾醇为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积。结果显示，各特征峰相对保留时间的RSD＜1%，单峰面积占总峰面积大于2%特征峰的相对峰面积RSD＜2%，采用Chempattern化学计量学软件进行评价，相似度为0.99，表明该方法重复性好。

4.4 冬虫夏草特征图谱的建立

取不同批次的野生冬虫夏草（样品1~17）粉末，精密称定，按“2.2”节下方法制备供试品溶液，精密吸取1 µL，分别进样测定，记录15 min的UPLC色谱图（图 1）。根据结果，采用Chempattern化学计量学软件进行数据分析处理，设定样品1为参照图谱，将其他样品的色谱峰与参照图谱进行自动匹配，生成野生冬虫夏草的特征图谱（图 2）。

4.5 特征峰的标定

根据17批野生冬虫夏草的特征图谱检测结果，共标定5个特征峰。经过与对照品比对，可知3号峰为麦角甾醇，其余4个峰根据二极管阵列检测器光谱特征与3号峰的相似性以及文献推测^[15]，也应为甾醇类成分。

4.6 冬虫夏草人工繁育品、野生品与凉山虫草特征图谱的比较

取不同批次的人工繁育品（样品18~27）和凉山虫草粉末（样品28~32），精密称定，按“2.2”节下方法制备供试品溶液，精密吸取1 µL，分别进样测定，记录15 min的UPLC色谱图（图 3~4）。根据结果，采用Chempattern化学计量学软件进行数据分析处理，计算野生品、人工繁育品与凉山虫草图谱的相似度（图 5），分别为0.97，1.00，0.97，0.99，0.98，1.00，1.00，1.00，1.00，0.98，0.95，0.99，1.00，1.00，1.00，0.99，1.00，1.00，0.99，0.99，0.99，0.99，1.00，1.00，1.00，0.96，0.93，0.80，0.76，0.76，0.75，0.74。由此可见，野生冬虫夏草与人工繁育品基本一致；与凉山虫草特征图谱差异较大。

5 冬虫夏草人工繁育品、野生品以及凉山虫草麦角甾醇的含量测定 5.1 系统适用性试验

按“3”节下色谱条件进行检测，以麦角甾醇计算理论塔板数大于6000，分离度大于1.5。记录对照品溶液及供试品溶液的色谱图（图 6）。

5.2 线性关系考察

精密吸取对照品储备液，加甲醇稀释成每1 mL分别含10.15、20.30、50.75、101.5、203.0、507.5µg的溶液，按上述色谱条件测定，以对照品浓度X（µg·mL^-1）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，得回归方程：

$ Y{\rm{ = 2432}}X{\rm{ + 3832}},r{\rm{ = 0}}.{\rm{999}} $

结果表明，麦角甾醇进样量在10.15~507.5µg·mL^-1与峰面积呈良好的线性关系。

5.3 精密度试验

精密吸取对照品溶液(101.5 µg·mL^-1)1 µL，按上述色谱条件连续进样6次，分别测定峰面积，结果峰面积的平均值为254674±1850，RSD＝0.42%，表明仪器精密度良好。

5.4 重复性试验

取本品粉末（18号样品），共6份，每份约0.2 g，精密称定，按“2.2”节下方法制备供试品溶液并进行测定，结果麦角甾醇平均含量为0.104%，RSD = 2.2%，表明本试验重复性良好。

5.5 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液(18号样品），分别于配制后0、2、4、8、12、24 h测定峰面积，麦角甾醇峰面积平均值为254814±2075，RSD＝0.68%，可知供试品溶液在24 h内稳定。

5.6 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一批样品（18号样品），共6份，每份约0.1 g，分别置具塞锥形瓶中，再分别依次精密加入浓度为20.30 µg·mL^-1的麦角甾醇对照品溶液5.0 mL和甲醇20.0 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率33 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22 µm的微孔滤膜过滤，取续滤液，分别按样品分析方法操作，测定每份含量，计算回收率，结果见表 1。

5.7 样品含量测定

对收集的各地样品，按“2.2”节下方法制备供试品溶液，进行测定，结果见表 2。

6 讨论 6.1 特征图谱

本文建立的基于甾醇的冬虫夏草UPLC特征图谱，标示5个特征峰，17批野生冬虫夏草、10批冬虫夏草人工繁育品与野生品对照图谱之间的相似度均大于0.9，相似度良好，两者成分比例相似；5批凉山虫草相似度均未超过0.8，均未检出5号峰，并且3号峰麦角甾醇峰明显偏高。

6.2 含量测定

本试验测定了10批冬虫夏草人工繁育品和17批野生冬虫夏草中麦角甾醇的含量，10批人工繁育品的平均含量为0.121%±0.031%；17批野生品的平均含量为0.115%±0.045%；5批凉山虫草的平均含量为0.468%±0.038%。人工繁育品批次之间差异性比野生品小。麦角甾醇含量采用统计学方法t检验进行分析，人工繁育品和野生品之间P＞0.05，说明冬虫夏草人工繁育品和野生品之间的麦角甾醇含量无显著性差异。冬虫夏草人工繁育品和野生品的含量与凉山虫草之间P均小于0.05，凉山虫草中麦角甾醇含量明显高于冬虫夏草人工繁育品和野生品。

6.3 小结

本实验在同一色谱条件下，建立了冬虫夏草人工繁育品和野生品基于甾醇的特征图谱，同时测定了麦角甾醇的含量，并以凉山虫草做参照，有助于冬虫夏草的种类鉴别，并且能够为冬虫夏草人工繁育品质量控制以及该药材的资源开发提供科学依据。