专利蓝Ⅴ是一种合成染料，与亚甲蓝同为三芳基甲烷类染料^[1]。一般以钠盐或钙盐形式用于食品添加剂的着色剂^[2-3]。专利蓝Ⅴ之前一直被用于淋巴管造影^[4]。最近，专利蓝Ⅴ被广泛应用于乳腺癌前哨淋巴结活检技术^[5-6]，也被用于其他恶性肿瘤包括皮肤黑色素瘤^[7]、宫颈癌^[8]和胃癌的检测^[9-10]。专利蓝Ⅴ钠盐注射液的法国生产企业采用光度测定法进行细菌内毒素检测。作为一种注射液，控制其产品质量，保证用药安全十分重要。光度测定法检查细菌内毒素的成本比较高，在我国检测细菌内毒素使用凝胶法更为普遍，所以本文对专利蓝Ⅴ号钠盐注射液进行凝胶法的细菌内毒素检查方法学研究。

1 仪器与试药

电热恒温水浴箱；旋涡混合器；试管恒温仪等。实验用玻璃器皿经250 ℃烘烤2 h以上。

专利蓝Ⅴ号钠盐注射液，2 mL：50 mg（批号：15PA601A，14PA605A，14PA606A）；鲎试剂，（湛江博康海洋生物有限公司，批号：1503050，灵敏度0.2 5 E U ·支^-1，规格0.1 mL·支^-1，湛江安度斯生物有限公司，批号：1505292，灵敏度0.25 EU·支^-1，规格0.1 mL·支^-1）；细菌内毒素工作标准品（中国食品药品检定研究院，批号：150601-201164，规格：100 EU·支^-1）；细菌内毒素检查用水（湛江博康海洋生物有限公司，批号：1303160，规格：5 mL·支^-1；湛江安度斯生物有限公司，批号：1305130，规格：5 mL·支^-1）。

2 方法与结果 2.1 细菌内毒素限值的确定

企业标准规定的细菌内毒素限值应设定为每1 mL中含内毒素的量小于35 EU。本品临床最大给药剂量为10 mL，根据《中国药典》2015年版四部通则1143细菌内毒素检查法^[11]和9301注射剂安全性检查法应用指导原则^[11]的规定，细菌内毒素的限值L=K/M，K为人每千克体重每小时最大可接受的细菌内毒素剂量，以EU·（kg · h）^-1表示，注射剂K=5 EU·（kg · h）^-1，以人的体重60 kg计算限值L，则L=30 EU·mL^-1。所以专利蓝Ⅴ号钠盐注射液细菌内毒素限值应设定为每1 mL中含内毒素的量小于30 EU。

2.2 鲎试剂灵敏度的复核

按《中国药典》2015年版四部通则1143的要求对所用的鲎试剂进行灵敏度复核，经复核，所用鲎试剂的灵敏度测定值均在0.5～2.0λ，符合规定。

2.3 供试品稀释浓度范围

厂家专利蓝Ⅴ号钠盐注射液有效稀释倍数（MVD）的计算公式MVD＝ L×C/λ；其中Ｌ为专利蓝Ⅴ号钠盐注射液的细菌内毒素限值30 EU·mL^-1。λ为鲎试剂标示灵敏度，目前市售鲎试剂灵敏度λ通常在0.5~0.03 EU·mL^-1。则最大有效稀释倍数（MVD_0.5~0.03）为60~960倍。

2.4 干扰预试验

取专利蓝Ⅴ号钠盐注射液，用细菌内毒素检查用水分别稀释至60、120、240、480、960倍，将此系列浓度溶液记为NPC。同时在上述试验液中加入细菌内毒素标准溶液，使每一浓度的试验液中均含有2λ（λ为所用鲎试剂的标示灵敏度）浓度的细菌内毒素，记此系列溶液为PPC。取灵敏度为0.25EU·mL^-1的2个不同厂家的鲎试剂，分别与上述PPC和NPC进行反应，每一浓度重复2管，并设阳性和阴性对照。结果见表 1。

干扰预试验结果表明：专利蓝Ⅴ号钠盐注射液与鲎试剂反应有干扰作用，但当稀释120倍以上时，可以消除干扰。

2.5 正式干扰试验

为了最终确认是否存在干扰因素的影响，进行正式干扰试验。取专利蓝Ⅴ号钠盐注射液用细菌内毒素检查用水稀释至120倍，用灵敏度为0.25 EU·mL^-1的鲎试剂进行试验，结果见表 2。

结果表明，测定的细菌内毒素检查用水的鲎试剂灵敏度（Es）均在标示的灵敏度（λ）0.5~2.0λ，测定的供试品鲎试剂灵敏度（Et）值均在0.5~2.0Es，表明采用凝胶法对专利蓝Ⅴ号钠盐注射液进行细菌内毒素检查是可行的。

2.6 供试品的细菌内毒素检查

根据干扰试验结果，本品采用上述制定的限值进行细菌内毒素检查。分别选用2个不同厂家生产的鲎试剂，按照《中国药典》2015年版四部通则1143进行供试品的细菌内毒素检查。结果由表 3可见，3批供试品的细菌内毒素检查结果符合规定。

3 讨论

目前《中国药典》仍以凝胶法作为法定的仲裁标准，因此，本研究采用凝胶法对专利蓝Ⅴ号钠盐注射液的细菌内毒素检查进行了研究，结果显示凝胶法也是可行的。试验使用2个不同厂家的鲎试剂，对3批样品分别进行了干扰试验，结果表明，高浓度专利蓝Ⅴ号钠盐注射液对鲎试剂与细菌内毒素的凝集反应有干扰作用，当最小稀释倍数为120倍时，可排除干扰作用。本试验为专利蓝Ⅴ号钠盐注射液计算并设定了细菌内毒素限值，以凝胶法考察了其可行性，为该药品安全用药提供了检验依据。