小米辣是茄科辣椒属小米辣Capsicum frutescens L.的果实，收录于《卫生部药品标准藏药第一册》中，具有提升胃温、杀虫的功效，用于胃寒、痔疮等疾病^[1]。小米辣分布于云南南部，生于山腰路旁，野生或栽培^[2]。小米辣味极辣，通常作调味品，辣椒碱类成分是其主要活性成分。辣椒素和二氢辣椒素在同属植物辣椒中含量测定研究较多^[3-8]。关于小米辣药材的含量测定报道较少，张幸福等建立HPLC法测定了辣椒素和二氢辣椒素的含量^[9-11]。同时测定小米辣中辣椒素、二氢辣椒素和降二氢辣椒素3种辣椒碱的含量尚未有报道。张晶等采用HPLC法测定了同属植物辣椒中这3种辣椒碱的含量^[12]。采用一测多评法测定辣椒碱类成分的研究未见报道。

“一测多评”法（quantitative analysis of multicomponents by single marker, QAMS）作为一种对多指标质量控制的有效方法，克服了对照品短缺这一问题；即只测定某个代表性成分（易得、廉价、有效），同时可计算出其它待测有效成分的含量，是一种适合中药特点的多指标质量评价的新模式^[13-15]。

本研究建立超高压液相色谱法（UPLC），以辣椒素对照品作为内标物，计算其与二氢辣椒素、降二氢辣椒素的相对校正因子，并考察方法耐用性及系统适用性，以验证一测多评法在小米辣多指标质量控制中应用的适用性及可行性。

1 仪器与试药

Thermo Ulitimate 3000型超高压液相色谱仪（热电公司），H-Class型超高压液相色谱仪（沃特世公司），QUINTIX313-1CN型万分之一电子天平（Sartorius公司），MSE125S型十万分之一电子天平（Sartorius公司），KQ-300DV型超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司），Milli-Q去离子水发生器（密理博公司）。

辣椒素（批号110839-201205）和二氢辣椒素（批号111666-201303）由中国食品药品检定研究院提供，降二氢辣椒素（批号KB5MDG26）由上海源叶生物技术有限公司提供，HPLC-DAD（面积归一化法）检测纯度均大于98.0%。甲醇、乙腈均为色谱纯，为Fisher公司产品；水为Milli-Q纯化水。

药材均来自产地采集，10批正品药材（编号1~10）经中国食品药品检定研究院民族药室鉴定为茄科辣椒属小米辣Capsicum frutescens L.的干燥成熟果实。

2 方法与结果 2.1 一测多评方法学考察 2.1.1 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY BEH C18(2.1mm×100 mm, 1.7 μm)；流动相：乙腈-水（50︰50）；流速：0.2 mL·min^-1，柱温30 ℃，检测波长280 nm，进样量1 μL。各峰与邻峰的分离度均大于1.5，理论塔板数按辣椒素计算在3000以上。对照品及供试品的色谱图见图 1。

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取降二氢辣椒素、辣椒素、二氢辣椒素对照品适量，加甲醇制成每1 mL分别含11.05、44.80、18.75 μg的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备

取本品粉末（过四号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-四氢呋喃（1︰1）混合溶液25 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率300 W，频率35 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇-四氢呋喃（1︰1）混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 线性范围考察

精密吸取上述混合对照品溶液0.2、0.5、1、1.5、2 μL，进样分析，每个浓度进样2次，取平均值。以进样量对峰面积积分值进行回归处理，得降二氢辣椒素、辣椒素和二氢辣椒素的标准曲线，结果见表 1，表明各化合物在相应范围内线性关系良好。

2.1.5 校正因子计算

以辣椒素为内标，按公式${f_{ks}} = \frac{{{f_k}}}{{{f_s}}} = \frac{{{W_k} \times {A_s}}}{{{W_s} \times {A_k}}}$，计算辣椒素对降二氢辣椒素和二氢辣椒素的相对校正因子，结果见表 2。

2.1.6 精密度试验

精密吸取同一混合对照品溶液1 μL，连续进样6次，记录降二氢辣椒素、辣椒素和二氢辣椒素的峰面积，其峰面积的RSD分别为0.47%、0.42%和0.92%。表明仪器精密度良好。

2.1.7 稳定性试验

取同一份供试品溶液（1号样品），分别于配制后0、2、4、8、12、24 h进样测定，结果降二氢辣椒素、辣椒素和二氢辣椒素峰面积的RSD分别为0.54%、1.02%、1.61%，表明处理后的样品在24 h内稳定。

2.1.8 重复性试验

称取同一批药材粉末（1号样品）0.5 g，共5份，精密称定，按“2.1.3”节方法制备供试品溶液，测定降二氢辣椒素、辣椒素和二氢辣椒素的百分含量分别为0.031%、0.389%和0.206%，RSD分别为1.16%、0.81%和0.58%。

2.1.9 加样回收率

加样回收率取同一批已知含量的样品粉末（1号样品）约0.25 g，共6份，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入浓度为降二氢辣椒素0.0806 mg·mL^-1、辣椒素0.948 mg·mL^-1、二氢辣椒素0.502 mg·mL^-1的对照品溶液各1 mL，再精密加入甲醇-四氢呋喃（1︰1）混合溶液22 mL，余下操作按“2.1.3”节方法制备供试品溶液，测定，计算加样回收率，结果见表 3~表 5。

2.2 校正因子重现性考察 2.2.1 色谱柱及高效液相色谱仪考察

取“2.1.2”节混合对照品溶液，分别进样0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 μL测定，按“2.1.5”节方法计算辣椒素对降二氢辣椒素、二氢辣椒素的相对校正因子(relative correction factors, RCF)。

试验考察了2台高效液相色谱系统：ThermoUlitimate 3000、Waters H-Class，以及5种色谱柱：Waters ACQUITY BEH C18(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)，Waters CORTECS C18（2.1mm×100 mm, 1.6 μm），Waters ACQUITY HSS T3C18(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm)，Agilent ZORBAXEclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm），ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm, 1.8μm），柱间RCF的RSD＜1%，说明RCF在不同色谱柱和仪器上的耐用性均较好，见表 6。

2.2.2 实验室考察

采用建立的一测多评试验方法在2个实验室进行试验，使用Waters ACQUITY BEH C18（2.1mm×100 mm, 1.7 μm）色谱柱，进行测定，结果见表 7。不同实验室测得的RCF相差不大，RSD＜0.6%，说明该方法耐用性较好。

2.3 待测组分色谱峰的定位

通过相对保留时间进行待测组分色谱峰的定位，结果见表 8。由表 8可知，各待测成分的相对保留值RSD＜3.0%，在不同仪器及规格色谱柱下目标成分的相对保留时间，可正确判断出目标峰的准确峰位置。

2.4 一测多评法与外标法测定结果的比较

精密吸取供试品溶液各1 μL，注入高效液相色谱仪，测定。采用一测多评法与外标法计算小米辣中降二氢辣椒素、辣椒素和二氢辣椒素的含量，结果见表 9。采用SPSS19.0软件计算2种方法的降二氢辣椒素和二氢辣椒素含量之间的Pearson系数。结果表明，2种方法所测的含量相似度极高；另其含量间的相对标准偏差亦在3%以内，表明2种方法所得的各批次药材的含量不存在显著性差异，一测多评法在小米辣辣椒碱中的应用是可行的。

3 讨论 3.1 供试品溶液制备方法的选择

考察了甲醇、甲醇-四氢呋喃（1︰1）2种溶剂对小米辣中3种生物碱提取效率的影响，由于辣椒碱极性较小，甲醇-四氢呋喃（1︰1）提取效率更好，故选择甲醇-四氢呋喃（1︰1）作为提取溶剂。以甲醇-四氢呋喃（1︰1）25 mL为溶剂，分别超声20、30、40 min，结果30 min、40 min均较20min提取完全，30 min、40 min的提取效果差异不大，故确定以甲醇-四氢呋喃（1︰1）超声提取30min，3种辣椒碱提取率较高, 分离度较好, 干扰的杂质峰较少, 且方法简单，成本较低。

3.2 波长的选择

对降二氢辣椒素、辣椒素和二氢辣椒素进行全波长扫描，其紫外吸收峰相似，均在280 nm处有最大吸收，故选择280 nm为检测波长。

3.3 校正因子的考察

为了验证所建立的3种辣椒碱成分的一测多评法的适用性及可行性，本研究进行了方法学考察以及系统适用性试验。通过在2台液相色谱仪：Thermo Ultimate 3000和Waters H-Class、5根不同品牌及型号的色谱柱，以及2个不同实验室的考察，结果表明降二氢辣椒素、二氢辣椒素与辣椒素之间的相对校正因子具有良好的重现性。

3.4 结论

本研究首次将一测多评法应用于小米辣药材的质量评价中，以辣椒素为内参物，分别建立二氢辣椒素、降二氢辣椒素相对于辣椒素的相对校正因子，分别采用外标法和一测多评法测定3种辣椒碱的含量，并通过相对标准偏差（RSD）和Pearson系数比较二者结果的相对误差。该法所得3种辣椒碱类成分含量与传统外标法所测得含量之间没有显著性差异，说明一测多评法可作为小米辣药材质量控制的有效方法之一；与外标法相比，能较大程度地节约多成分含量测定的检验成本，并有利于控制药材的质量，可为其他民族药多成分定量提供技术参考。