2017, Vol. 31 
注射用奥扎格雷钠用于治疗急性血栓性脑梗塞和脑梗塞所伴随的运动障碍，以及改善蛛网膜下腔出血手术后的脑血管痉挛收缩和并发的脑缺血症状[1-3]。该产品以国家食品药品监督管理局标准YBH09742005和YBH15602005为依据，均以家兔法进行热原物质检查。但家兔法操作复杂、耗时；而细菌内毒素检查法简便、快捷，且检测灵敏度高[4]。本试验根据静脉用药时细菌内毒素总限量[5-7]确定注射用奥扎格雷钠细菌内毒素的限值，按照《中国药典》2015年版四部通则[8]建立该产品的细菌内毒素检查法，以确保临床用药安全。
1 仪器与材料 1.1 仪器恒温水浴箱(JULABO，型号：TW20)，涡旋混合器(IKA，型号：MS3 digital)，电热鼓风干燥箱(上海三发科学仪器有限公司，型号：DHG-9101-35A)。
1.2 样品及试药注射用奥扎格雷钠(山东罗欣药业集团股份有限公司，批号：516022081，516042182，516062181，家兔法热原检查均为阴性)。鲎试剂(湛江安度斯生物有限公司，批号：1602221，标示灵敏度：0.25EU·mL-1; 福州新北生化工业有限公司，批号：16032112, 标示灵敏度：0.25EU·mL-1; 湛江安度斯生物有限公司，批号：1412013, 标示灵敏度：0.5EU·mL-1; 福州新北生化工业有限公司，批号：15011912, 标示灵敏度：0.5EU·mL-1)。细菌内毒素检查用水(福州新北生化工业有限公司，批号：13090715)。细菌内毒素工作标准品(中国食品药品检定研究院，批号：150601-201580，规格：80EU/支)。
2 方法与结果 2.1 鲎试剂灵敏度复核按《中国药典》2015年版四部通则细菌内毒素检查法进行操作，结果显示试验用鲎试剂灵敏度均在0.5范围内，符合规定，可用于细菌内毒素检查。结果见表 1、表 2。
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表 1 鲎试剂(λ=0.5 EU·mL-1)灵敏度复核实验结果 |
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表 2 鲎试剂(λ=0.25 EU·mL-1)灵敏度复核实验结果 |
按联合用药内毒素总限量确定：本品用法用量为成人一次80 mg，一天2次，溶于500 mL生理盐水或5%葡萄糖溶液中，静脉滴注。生理盐水或5%葡萄糖溶液的内毒素限值均为0.5 EU·mL-1，则500 mL内毒素量为500mLx0.5 EU·mL-1= 250 EU，—人每小时可接受的最大内毒素量为60 kg × K = 60 kg × 5 EU/(kg·h) =300 EU·h-1(中国人均体重按60kg计算，K为人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量[9-10])，则注射用奥扎格雷钠细菌内毒素理论限值为(300 EU-250 EU)·h-1/80 mg·h-1=0.625 EU·mg-1。
2.2.2 最大有效稀释浓度(MVC)的确定目前，市售鲎试剂灵敏度通常在0.5 EU·mL-1~0.03 EU·mL-1之间，根据公式MVC=λ/L计算，式中L为供试品的细菌内毒素限值，λ为鲎试剂的标示灵敏度。则灵敏度为0.5 EU·mL-1、0.25 EU·mL_、0.125 EU·mL-1、0.06 EU·mL-1、0.03 EU·mL-1鲎试剂对应的MVC分别为0.8 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1。每一稀释浓度下做2支供试品管和2支供试品阳性对照(即含2个内毒素的供试品稀释液)。同时另取2支加入细菌内毒素检查用水作为阴性对照，2支加入2浓度的内毒素标准品做阳性对照。使用标示灵敏度为0.25 EU·mL-1的2个厂家的鲎试剂。
注射用奥扎格雷钠的干扰预试验表明，阴性对照结果为阴性，阳性对照结果为阳性，试验有效。注射用奥扎格雷钠对细菌内毒素与鲎试剂的反应无干扰作用，最大有效稀释浓度为0.8 mg·mL-1。
2.3 干扰试验取1支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成2.0、1.0、0.5、0.25λ 4个浓度的内毒素标准溶液，每一浓度平行做2管。将注射用奥扎格雷钠溶解稀释至最大不干扰浓度，再用此溶液将内毒素标准品稀释成2.0、1.0、0.5、0.25λ 4个浓度的含内毒素的供试品溶液，每一浓度平行做4管。选用2个厂家的灵敏度为0.25 EU·mL-1的鲎试剂做干扰试验，注射用奥扎格雷钠选择3个批号。同时用细菌内毒素检查用水做阴性对照，平行做2管。结果见表 3、表 4。
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表 3 干扰试验结果(福州新北) |
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表 4 干扰试验结果(湛江安度斯) |
从干扰试验结果看出，2个厂家的鲎试剂、3个批号的注射用奥扎格雷钠的Es、Et值均符合Es在0.5 ~ 2.0人之间，且Et在0.5 ~ 2.0 Es之间(包括0.5 Es和2.0 Es)的要求。说明注射用奥扎格雷钠稀释到0.8 mg·mL-1浓度时对鲎试剂无干扰。
2.4 细菌内毒素检测结果将3批样品分别溶解至0.8 mg·mL-1，用灵敏度0.5 EU·mL-1的鲎试剂进行细菌内毒素检查，同时做供试品阳性对照、阳性对照和阴性对照，按照《中国药典》2015年版四部通则1143细菌内毒素检查法操作。结果表明，3批供试品均为阴性，与家兔法进行的热原检查阴性结果相吻合。结果见表 5。
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表 5 供试品细菌内毒素检查结果 |
药品是否可用细菌内毒素检查法替代家兔法热原检查，首先要证实是否存在干扰因素，确定该品种在有效浓度范围内进行细菌内毒素检查时既可以克服干扰因素，又能客观地反映其所含细菌内毒素的限值[11]。本实验按《中国药典》2015年版四部通则1143进行细菌内毒素检查法的研究，结果表明：注射用奥扎格雷钠浓度为0.8 mg·mL-1时对细菌内毒素检查法无干扰作用。采用凝胶法，用灵敏度为0.5 EU·mL-1鲎试剂和浓度为0.8 mg·mL-1的注射用奥扎格雷钠进行细菌内毒素检查，3个批号供试品结果均符合规定。因此，本品可用细菌内毒素检查法代替家兔热原法。
| [1] |
王成湖, 易林高. 注射用奥扎格雷钠与含果糖注射液的配伍稳定性考察[J]. 中国药房, 2016, 27(2): 191-192. |
| [2] |
孟王玲, 孟祥军, 葛欣. HPLC法测定奥扎格雷钠注射液的含量[J]. 中国现代药物应用, 2010, 4(21): 32-33. DOI:10.3969/j.issn.1673-9523.2010.21.019 |
| [3] |
刘伟强. 奥扎格雷钠注射液制备工艺研究[J]. 医学信息, 2011, 24(10): 6801-6802. DOI:10.3969/j.issn.1006-1959.2011.10.472 |
| [4] |
梦婷, 康军, 刘向萍, 等. 细菌内毒素法检查注射用奥扎格雷钠热原[J]. 武警医学院学报, 2007, 16(3): 297-298. |
| [5] |
肖贵南, 孙清萍, 盛英美. 如何建立新药的细菌内毒素检查方法[J]. 工作探讨, 2011, 8(32): 159-162. |
| [6] |
周素文, 李波. 细菌内毒素检查法常见问题[J]. 科技园地, 2006, 41(19): 1516-1518. |
| [7] |
张虞婷, 丁苏苏, 李倚云. 细菌内毒素的研究进展及其检查法的应用[J]. 天津药学, 2015, 27(5): 66-69. |
| [8] |
中国药典四部[S].2015.
|
| [9] |
杨娟, 李晟刚, 朱爱民. 环磷腺苷注射液细菌内毒素检查方法探讨[J]. 科技交流, 2013, 16(1): 144-145. |
| [10] |
杨娟, 李晟刚, 邵磊. 卡络磺钠注射液细菌内毒素检查方法研究[J]. 中国药事, 2013, 27(8): 887-889. |
| [11] |
肖贵南, 区璇, 陆惠文, 等. 盐酸普罗帕酮注射液细菌内毒素的鲎试验研究[J]. 中国药理学通报, 2004, 20(2): 226-229. |