注射用二乙酰胺乙酸乙二胺是一种抗纤维溶解类止血药，临床上用于预防和治疗各种原因出血，如手术渗血、外科出血、颅脑出血等。为了探讨鲎试剂（TAL）法检查细菌内毒素的可行性，本试验对注射用二乙酰胺乙酸乙二胺细菌内毒素检查进行了研究。

1 材料 1.1 试剂

鲎试剂：批号：1504271，λ=0.25 EU·mL^-1，规格：0.1 mL，湛江安度斯生物有限公司；批号：1411130，λ=0.25 EU·mL^-1，规格：0.1 mL，湛江博康海洋生物有限公司。细菌内毒素工作标准品：批号：150601-201580，效价：80 EU/支，中国食品药品检定研究院。细菌内毒素检查用水：批号：1510270，规格：50 mL，湛江安度斯生物有限公司。

1.2 仪器

鼓风干燥箱：型号：DHG-9245A，上海一恒科学仪器有限公司；试管恒温仪：型号：TAL-40D，湛江安度斯生物有限公司；旋涡混合器：型号：ZH-2，天津药典标准仪器厂；洁净工作台：型号：SW-CJ-1FD，苏州安泰空气技术有限公司。

1.3 样品

注射用二乙酰氨乙酸乙二胺，规格：0.4 g，批号：20141201、20141202、20141203，江苏大同盟制药有限公司。

2 方法与结果 2.1 细菌内毒素限值的确定

细菌内毒素限值的确定根据《中国药典》2015年版四部通则1143规定的方法，根据公式L=K/M，式中K=5 EU·kg^-1·h^-1，为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，根据药品使用说明书，成人一次最大给药剂量为1.2 g，人均体重按60 kg计算，滴注时间按1 h计算，则M=20mg·kg^-1·h^-1,计算得L=0.25 EU·kg^-1 ,出于对化学药品注射剂安全性考虑，将计算值严格控制至1/3~1/2。故拟定本品的细菌内毒素限值为0.12 EU·mg^-1。

2.2 鲎试剂灵敏度复核

鲎试剂灵敏度复核按《中国药典》2015年版四部通则1143进行，根据TAL灵敏度的标示值，将细菌内毒素工作标准品用BET水溶解，在旋涡混合仪上充分混合15 min，然后将混匀的细菌内毒素工作标准品溶液稀释成2λ、λ、0.5λ、0.25λ四个浓度，每一浓度平行4管进行试验，结果表明：试验用2个厂家的鲎试剂灵敏度值均在0.5~2λ，符合规定，可用于本试验。

2.3 干扰试验预试验

供试品溶液的制备：取本品1瓶，加检查用水2 mL制成供试品溶液200 mg·mL^-1。

通常用鲎试剂灵敏度（λ）为0.5~0.03 EU·mL^-1，据MVD＝CL/λ，则样品的最大有效稀释倍数为48~800倍，因此采用48、96、192、400、800倍的稀释液为系列供试品溶液（NPC）。同时根据所用鲎试剂的灵敏度，使上述NPC系列溶液中含2λ的细菌内毒素标准品溶液，制成供试品阳性溶液为PPC系列溶液。取2个厂家的鲎试剂分别与上述NPC、PPC系列溶液反应，每一浓度重复两管，并设阳性（PC）和阴性（NC）对照，结果注射用二乙酰氨乙酸乙二胺的最小不干扰稀释倍数为48倍，见表 1。

2.4 正式干扰试验

为进一步确认是否存在干扰因素的影响，选用λ=0.25 EU·mL^-1的鲎试剂进行正式干扰试验。

分别用上述2个厂家的鲎试剂考察样品在稀释倍数为96倍时的干扰情况，取3批注射用二乙酰氨乙酸乙二胺用BET水稀释至96倍，用48倍样品溶液和BET水分别将细菌内毒素标准品制成0.5、0.25、0.125、0.06 EU·mL^-1的系列浓度，与2个厂家灵敏度为0.25 EU·mL^-1的鲎试剂反应，用48倍样品溶液稀释的细菌内毒素标准品系列，每一浓度重复2管，用BET水稀释的细菌内毒素标准品系列，每一浓度重复4管，同时做阴性对照，结果见表 2。E_s和E_t均在0.5~2λ，符合灵敏度复核试验要求，表明3批样品在稀释倍数为96倍时对试验均没有干扰作用。

2.5 样品细菌内毒素检查

根据正式干扰试验结果，取3个批号样品，用BET水分别稀释成96倍液，对注射用二乙酰氨乙酸乙二胺采取上述制定的限值并分别用2个不同厂家的鲎试剂进行细菌内毒素检查，按《中国药典》2015年版四部通则1143细菌内毒素检查法进行试验，3批样品检查结果完全符合标准规定，见表 3。

3 讨论

1）在检查操作中，为防止内毒素污染试剂，实验室要保持洁净，所用的器皿必须要洗涤干净，玻璃器皿要经过高温除热原处理，避免外源性内毒素影响试验结果。

2）本试验用2个不同厂家的鲎试剂对连续3个批号的注射用二乙酰氨乙酸乙二胺进行了干扰试验，结果表明，E_s和E_t均在0.5~2λ，符合灵敏度复核试验要求，说明3个批号样品在稀释倍数为96倍时对试验没有干扰作用。

3）用2个厂家鲎试剂与3个批号样品的96倍液进行细菌内毒素检查，结果表明，样品细菌内毒素限值均在0.12 EU·mg^-1以下，样品细菌内毒素限量均合格。

4）根据试验结果，确定注射用二乙酰氨乙酸乙二胺细菌内毒素检查方法：取本品，依法检查（《中国药典》2015年版四部通则1143），每1 mg二乙酰氨乙酸乙二胺中含内毒素的量应小于0.12 EU。