吡诺克辛钠滴眼液是眼科用药，用于治疗初期老年性白内障、轻度糖尿病性白内障或并发性白内障等。国内有1 0余家企业生产该制剂，规格为15 mL：0.8 mg。该滴眼液由药片与专用溶剂组成，临用时配制成滴眼液，药片含吡诺克辛钠，专用溶剂中含有抑菌剂。研究各厂家的说明书，该滴眼剂中单独或联合使用了硫柳汞钠、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯作为抑菌剂。近年来，随着研究者对滴眼剂安全性关注度的提高，有关滴眼剂中抑菌剂对眼组织造成损害及刺激性的研究日益增多^[1-3]。

文献^[4]报道，吡诺克辛钠在临床使用过程中出现了说明书以外的不良反应，除了与主药自身或杂质有关，也可能与专用溶剂的抑菌剂有关。近年来，对吡诺克辛钠滴眼液的药片中有关物质的报道^[5-7]很多，鲜有对专用溶剂中抑菌剂的报道。为控制滴眼剂质量，笔者采用同一色谱条件，同时对该滴眼剂中抑菌剂的含量进行测定。

1 材料 1.1 仪器

1260HPLC仪（美国Agilent公司）；MettlerXS105DU电子天平；Mettler PB-10 pH计。

1.2 试药

硫柳汞钠对照品（批号：135050-201401，纯度94.6%，中国食品药品检定研究院）；羟苯甲酯对照品（批号：100278-201103，纯度99.6%，中国食品药品检定研究院）；羟苯乙酯对照品（批号：100847-201203，纯度100%，中国食品药品检定研究院）；羟苯丙酯对照品（批号：100444-201102，纯度99.6%，中国食品药品检定研究院）；吡诺克辛钠滴眼液（厂家A, 批号为13110307、14040306、15040310，规格为15 mL：0.8 mg；厂家B，批号为131017014，规格为15 mL：0.8 mg；厂家C，批号为131206，规格为15 mL：0.8 mg；厂家D，批号为130703，规格为15 mL：0.8 mg。乙腈为色谱纯，水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

1.3 不同厂家吡诺克辛钠滴眼液中所加抑菌剂的种类

不同厂家吡诺克辛钠滴眼液说明书中标注抑菌剂的种类详见表 1。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB C18（4.6 mm×150 mm，5μm）；流动相：0.005 mol·L^-1的醋酸铵溶液（每1000 mL中含三乙胺10 mL，用冰醋酸调节pH值至5.0±0.5）-乙腈（70 ︰ 30）；流速为min^-1；检测波长256 nm；柱温为30℃; 进样量20 μL。结果硫柳汞钠、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯依次出峰，理论板数按硫柳汞钠计算不低于7000，分离度分别为10.3、13.3和16.9。色谱图见图 1。

2.2 溶液制备 2.2.1 对照品溶液

精密称取硫柳汞钠对照品0.0946 g，置100 mL量瓶中，加水适量使溶解（避光操作）；精密称取羟苯甲酯0.01127 g、羟苯乙酯0.01361 g和羟苯丙酯0.01079 g，分别置20 mL量瓶中，加水适量，置水浴溶解后，放冷，再加水稀释至刻度，作为贮备液（酯类对照品贮备液过夜会有结晶析出，重新水浴加热溶解，混匀，不影响浓度）。

2.2.2 供试品溶液

取专用溶剂原液根据各厂家不同抑菌剂实际含量，选择原液或者稀释5倍，作为最终供试品溶液。各厂家原液供试品色谱图见图 2。

2.3 线性关系考察

精密量取硫柳汞钠贮备液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL和羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯贮备液0.1、0.2、0.5、1、2 mL，分别置10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，作为混合标准系列溶液。各取20 μL注入液相色谱仪，测定。以峰面积为纵坐标Y，浓度X（μg·mL^-1）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：

Y_硫柳汞钠 =14.993X-10.279  r=0.9993

Y _羟苯甲酯 =116.83X+23.97  r=1.000

Y _羟苯乙酯 =109.09X-37.536  r=0.9999

Y _羟苯丙酯 =92.346X-70.539  r=0.9996

硫柳汞钠、羟苯甲酯、羟苯乙酯和羟苯丙酯的线性范围分别为0.8949~2.6847、5.6125~112.25、6.8050~136.10和5.3734~107.47 μg·mL^-1。

2.4 精密度试验

取硫柳汞钠贮备液0.3 mL与羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯贮备液0.5 mL，置同一10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，制成混合标准溶液，连续进样6次，记录色谱图，计算峰面积的RSD分别为1.4%、0.1%、0.1%、0.1%（n=6）。

2.5 重复性试验

取批号为15040310的样品（说明书中标注含硫柳汞钠和羟苯乙酯）中的专用溶剂直接进样，测定硫柳汞钠的含量分别为1.15、1.13、1.12、1.12、1.15、1.11 μg·mL^-1，RSD为1.5%（n=6）；取专用溶剂5 mL，置25 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，测定羟苯乙酯含量分别为217.8、217.5、217.6、216.9、216.8、217.0 μg·mL^-1，RSD为0.2%（n=6）。取批号为131017014的样品（说明书中标注含羟苯甲酯和羟苯丙酯）中的专用溶剂5 mL，置25 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，测定羟苯甲酯含量分别为179.4、180.6、180.0、179.5、178.9、179.3 μg·mL^-1，RSD为0.4%（n=6）；取专用溶剂直接进样，测定羟苯丙酯的含量分别为74.4、74.5、73.9、74.7、73.8、74.3 μg·mL^-1，RSD为0.5%（n=6）。

2.6 稳定性试验

取标准曲线中间点的混合标准溶液，在室温下放置，于0、3、5、8、10、12 h时测定，结果硫柳汞钠、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯峰面积的RSD分别为1.8%、0.1%、0.1%、0.1%（n=6），表明溶液在12 h内稳定。

2.7 准确度试验

取“2.5”节中测定溶液5 mL，置10 mL量瓶中，分别加入近等量的相应对照品溶液，用水稀释至刻度，制成相当于防腐剂质量浓度80%、100%、120%的溶液，测定其含量，计算回收率。试验结果如表 2~5所示，表明该方法准确度良好。

2.8 检测限与定量限试验

取混合标准溶液，逐级稀释进样，按信噪比为3计，确定硫柳汞钠、羟苯甲酯、羟苯乙酯和羟苯丙酯的检测限分别为2.3、0.4、0.7、1.1 ng；按信噪比为10计，确定硫柳汞钠、羟苯甲酯、羟苯乙酯和羟苯丙酯的定量限分别为7.7、0.8、1.4、2.1 ng。

2.9 样品测定

取4个厂家7批制剂，按“2.2.2”节方法制备溶液，按外标法以峰面积计算硫柳汞钠、羟苯甲酯、羟苯乙酯和羟苯丙酯的含量。结果见表 6。

3 讨论 3.1 分析方法的选择

《中国药典》2015年版四部^[8]收载了尼泊金酯类的含量测定方法，还有硫柳汞的两种检验方法，分别为滴定法和原子吸收分光光度法。滴眼剂中有关尼泊金酯类含量测定方法的相关文献亦常见^[9-13]。

《中国药典》2010年版二部收载了检验盐酸环丙沙星滴眼液^[14]中羟苯乙酯的方法，同时用羟苯甲酯和羟苯丙酯作为系统条件。本试验在保证良好的系统条件的前提下，大大降低了乙腈的用量，收到了良好的效果。

3.2 辅料对测定的影响

吡诺克辛钠滴眼液由药片和专用溶剂组成。本文抑菌剂是指专用溶剂中的抑菌剂，4个厂家的专用溶剂辅料中均含有硼酸、硼砂、氯化钾（氯化钠），均对试验无干扰。厂家B说明书中标注还添加了氢氧化钠，在氢氧化钠水溶液中，羟苯甲酯、羟苯丙酯分别发生反应，生成羟苯甲酯钠与羟苯丙酯钠，峰面积换算系数为1.145、1.122^[15]。从羟苯甲酯与羟苯丙酯的回收率看，厂家B未添加或添加少量的氢氧化钠，联系厂家后得到证实未添加氢氧化钠。

3.3 抑菌剂的种类及含量

眼用制剂中的抑菌剂根据其化学结构和性质可分为以下几类: ① 有机汞类，如硫柳汞、硝酸汞；② 季铵盐类，如苯扎氯铵、苯扎溴铵等；③ 醇类，如三氯叔丁醇；④ 酯类，常用的为羟苯酯类，如羟苯甲酯、羟苯乙酯等；⑤ 酸类，如山梨酸^[2]。吡诺克辛钠滴眼液中使用的为有机汞类和酯类。酯类常用的为尼泊金类，以羟苯乙酯为主，羟苯乙酯因化学性质稳定、配伍禁忌较少，以及对眼部的刺激性较小，目前已成为滴眼剂中的主要抑菌剂。羟苯乙酯单独使用其有效浓度为0.03%~0.06%；羟苯甲酯与羟苯丙酯合用，其浓度分别为0.16%、0.02%^[3]。硫柳汞钠为有机汞类抑菌剂，常用于滴眼剂和疫苗的防腐，滴眼剂抑菌浓度为0.02%~0.04%，稳定性较差，日久会变质，须关注其与处方中其他成分的相互作用^[16]。

本试验中，厂家A不同批次添加硫柳汞钠浓度相对稳定，为0.0001%（g·mL^-1），羟苯乙酯为0.02%；厂家B羟苯甲酯为0.02%，羟苯丙酯为0.01%；厂家C羟苯甲酯为0.02%，羟苯丙酯为0.01%；厂家D羟苯乙酯为0.04%。从表 3可以看出，4个厂家均联合使用了抑菌剂，但与说明书中（表 1）的标注有出入。因此，厂家应规范处方中抑菌剂的种类及标示量，加强质量控制。