2017, Vol. 31 
奥曲肽（Octreotide）为8个氨基酸组成的环状多肽化合物，是生长抑素类似物，主要与肿瘤细胞或其他组织细胞膜表面上所表达的生长抑素受体高亲和性、特异性地结合，抑制垂体生长激素以及胃肠胰腺系统分泌多肽类激素[1-4]，临床使用其醋酸盐，给药途径为皮下及静脉给药。目前，国内批准上市的醋酸奥曲肽注射剂为醋酸奥曲肽注射液及注射用醋酸奥曲肽。醋酸奥曲肽注射液有5个规格：1 mL:0.05 mg、1 mL:0.1 mg、1 mL:0.15 mg、1 mL:0.2 mg及1 mL:0.3 mg，注射用醋酸奥曲肽有2个规格：0.1 mg及0.3 mg。
2015年版《中国药典》规定，静脉给药的注射剂均不得加抑菌剂[5]。调研发现，醋酸奥曲肽注射剂对高温敏感，企业均采用薄膜过滤除菌而非高温灭菌，个别企业可能会添加抑菌剂，以降低除菌不彻底的风险。注射剂中常加入的抑菌剂主要有醇类（苯甲醇、三氯叔丁醇）、酚类（苯酚）、酯类（羟苯酯类）等[6-13]，不同种类的抑菌剂通过不同的作用机理而产生抑菌作用。但抑菌剂的大量使用可发生一些不良反应，如苯酚可导致头痛及免疫抑制等，苯甲醇可导致中枢神经系统毒性，三氯叔丁醇可导致溶血反应，羟苯酯类可导致过敏反应等[14-15]，因此，有必要对醋酸奥曲肽注射剂进行抑菌剂检查。本文建立了HPLC同时测定苯酚、苯甲醇、三氯叔丁醇、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯5种抑菌剂的方法，该方法操作简便、重复性好，可监测该品种中抑菌剂的添加情况，确保该产品的质量安全稳定。
1 仪器与试药Waters 2690高效液相色谱仪，Waters 2996二极管阵列检测器及Waters 2487紫外检测器，Empower色谱工作站；Sartorius BP211D电子天平；Millipore去离子水发生装置（德国Merck Millipore）。
苯酚标准品（Sigma-alorich，批号SZBD127XV，含量99.9%）；苯甲醇标准品（中国食品药品检定研究院，批号190019-201301，含量99.8%）；三氯叔丁醇标准品（中国食品药品检定研究院，批号100492-201302，含量100.0%）；对羟基苯甲酸甲酯标准品（中国食品药品检定研究院，批号100278-201404，含量100.0%）；对羟基苯甲酸丙酯标准品（中国食品药品检定研究院，批号100444-201403，含量99.6%）。醋酸奥曲肽注射液（2015年国家评价性抽验样品，来源于11家企业，70批次，规格1 mL:0.05 mg、1 mL:0.1 mg、1 mL:0.15 mg、1 mL:0.2 mg及1 mL:0.3 mg）；注射用醋酸奥曲肽（2015年国家评价性抽验样品，来源于6家企业，21批次，规格0.1 mg及0.3 mg）；原研醋酸奥曲肽注射液（诺华制药，批号S0369，规格0.1 mg·mL-1）。甲醇为色谱纯，水为纯净水。
2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱为Agela Venusuil ASB C18(L)（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流动相A为水，流动相B为甲醇，梯度洗脱，洗脱程序见表 1，流速1.0 mL·min-1，UV双波长检测，检测波长为220 nm及256 nm，柱温30℃，进样量20 μL。
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表 1 HPLC梯度洗脱程序 |
抑菌剂混合对照品溶液：精密称取苯酚、苯甲醇、三氯叔丁醇、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯标准品适量，加甲醇-水（1:1）溶液溶解并稀释成浓度分别为50.0 μg·mL-1、100.0 μg·mL-1、500.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1的溶液。
醋酸奥曲肽注射液供试品溶液：取本品作为供试品溶液，或精密量取本品适量，加水稀释成含奥曲肽浓度为0.1 mg·mL-1的溶液。
注射用醋酸奥曲肽供试品溶液：取本品2瓶，按标示量加水溶解并稀释成含奥曲肽浓度为0.1 mg·mL-1的溶液。
2.3 系统适用性精密量取“2.2”节下抑菌剂混合对照品溶液，进样20 μL，记录色谱图，结果系统适用性试验溶液的色谱图中各成分出峰顺序依次为苯酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、三氯叔丁醇及对羟基苯甲酸丙酯，见图 1。各相邻峰之间的分离度均不小于1.5。
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图 1 系统适用性试验溶液的色谱图 |
精密吸取甲醇-水（1:1）溶液，得空白溶液进样20μL；按醋酸奥曲肽注射剂处方比例制备辅料溶液，进样20μL。结果表明，空白溶液及辅料均对苯酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、三氯叔丁醇及对羟基苯甲酸丙酯5种抑菌剂无干扰，见图 2。
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图 2 空白辅料色谱图 |
精密称取苯酚、苯甲醇、三氯叔丁醇、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯标准品适量，加甲醇-水（1:1）溶解并稀释成浓度分别为260.0 μg·mL-1、550.0 μg·mL-1、2000.0 μg·mL-1、100.0 μg·mL-1、100.0 μg·mL-1的溶液。精密量取该溶液，逐级稀释成含苯酚浓度为1.29、2.59、6.47、12.93、19.40、25.86、64.65、129.30、193.95、258.60 μg • mL-1的系列对照品溶液；含苯甲醇浓度为2.72、5.44、13.61、27.21、40.82、54.42、136.05、272.1、408.15、544.20μg·mL-1的系列对照品溶液；含三氯叔丁醇浓度为9.95、19.90、49.75、99.50、149.25、199.00、497.50、995.00、1492.50、1990.00 μg • mL-1的系列对照品溶液；含对羟基苯甲酸甲酯浓度为0.27、0.54、1.35、2.69、4.04、5.38、13.45、26.90、40.35、53.80 μg • mL-1的系列对照品溶液；含对羟基苯甲酸丙酯浓度为0.26、0.52、1.30、2.60、3.90、5.20、13.00、26.00、39.00、52.00 μg·mL-1的系列对照品溶液；分别进样20 μL，记录色谱图，以峰面积Y为纵坐标，进样浓度X（μg·mL-1）为横坐标进行线性回归，得苯酚、苯甲醇、三氯叔丁醇、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯5个成分的回归方程（n=10）：
苯酚Y=72002X-18657（r=1.0000）；
苯甲醇Y=74547X+163087（r=0.9997）；
三氯叔丁醇Y=910.61X-3404.7（r=1.0000）；
对羟基苯甲酸甲酯Y=125139X-14319（r=1.0000）；
对羟基苯甲酸丙酯Y=107784X-10311（r=1.0000）。
结果苯酚浓度在1.29~258.60 μg·mL-1范围内，苯甲醇浓度在2.72~544.20 μg·mL-1范围内，三氯叔丁醇浓度在9.95~1990.00 μg·mL-1范围内，对羟基苯甲酸甲酯浓度在0.27~53.80 μ g · mL-1范围内，对羟基苯甲酸丙酯浓度在0.26~52.00 μg·mL-1范围内，均与峰面积呈现良好的线性关系。
2.6 精密度试验取“2.2”节下抑菌剂混合对照品溶液，连续进样6次，苯酚、苯甲醇、三氯叔丁醇、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯峰面积的RSD分别为0.2%、0.1%、0.3%、0.1%、0.2%，结果表明该方法精密度良好。
2.7 定量限与检测限逐级稀释“2.2”节下抑菌剂混合对照品溶液，以信噪比（S/N）为10:1计，苯酚、苯甲醇、三氯叔丁醇、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯的最低定量限分别为0.3 ng、0.3 ng、199.0 ng、0.6 ng、0.6 ng。
以信噪比（S/N）为3 :1计，苯酚、苯甲醇、三氯叔丁醇、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯的最低检测限分别为0.08 ng、0.1 ng、0.2 ng、0.2 ng。
2.8 稳定性试验精密称取苯酚、苯甲醇、三氯叔丁醇、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯适量，用“2.2”节下醋酸奥曲肽供试品溶解并稀释成含苯酚、苯甲醇、三氯叔丁醇、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯分别为50.0 μg·mL-1、100.0 μg · mL-1、500.0 μg · mL-1、10.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1的溶液，按上述色谱条件测定并记录色谱图，测定24 h内溶液的稳定性，分别以各成分峰面积为指标考察溶液稳定性。结果见表 2，苯酚、苯甲醇、三氯叔丁醇、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯峰面积的RSD分别为0.4%、0.3%、2.0%、0.2%、0.2%，表明含苯酚、苯甲醇、三氯叔丁醇、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯供试品溶液24 h内稳定性良好。
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表 2 稳定性试验结果 |
取醋酸奥曲肽注射剂适量，加水制成含奥曲肽浓度为0.1 mg·mL-1的供试品溶液。再分别精密称取苯酚、苯甲醇、三氯叔丁醇、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯适量，用上述醋酸奥曲肽供试品溶液溶解，分别制成高、中、低浓度的溶液，进样，以苯酚、苯甲醇、三氯叔丁醇、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯各对照品为外标计算回收率。结果苯酚平均回收率（n=9）为100.0%，RSD（n=9）为1.5%；苯甲醇平均回收率（n=9）为100.3%，RSD（n=9）为0.9%；三氯叔丁醇平均回收率（n=9）为100.9%，RSD（n=9）为1.2%；对羟基苯甲酸甲酯平均回收率（n=9）为100.5%，RSD（n=9）为0.8%；对羟基苯甲酸丙酯平均回收率（n=9）为99.4%，RSD（n=9）为0.8%；见表 3。
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表 3 回收率试验结果 |
对70批醋酸奥曲肽注射液、21批注射用醋酸奥曲肽及原研企业的1批醋酸奥曲肽注射液样品进行苯酚、苯甲醇、三氯叔丁醇、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯5种抑菌剂检查，结果均未检出以上抑菌剂。醋酸奥曲肽注射剂抑菌剂检查色谱图见图 3。
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图 4 醋酸奥曲肽注射剂抑菌剂检查色谱图 A.注射液；B.粉针剂。 |
采用二极管阵列检测器对抑菌剂混合对照品溶液进行分析，得各成分的吸收光谱图，各成分最大紫外吸收波长：苯酚216 nm、苯甲醇211 nm、三氯叔丁醇210 nm、对羟基苯甲酸甲酯256 nm、对羟基苯甲酸丙酯256 nm。苯酚、苯甲醇、三氯叔丁醇均为末端吸收，综合考虑各峰的灵敏度及峰形，最终选择苯酚、苯甲醇、三氯叔丁醇检测波长为220 nm，对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯检测波长为256 nm。
3.2 抑菌剂对照品溶液的浓度5种抑菌剂在注射剂中的常用量：苯酚0.5%，苯甲醇1.0%，三氯叔丁醇0.5%及羟苯酯类0.15%[4]，依据此用量设计抑菌剂各对照品的浓度。三氯叔丁醇由于紫外响应较低，适当地增加了其浓度，但该方法中三氯叔丁醇的检测限为99.5 ng，可满足检测要求。
3.3 样品质量分析70批醋酸奥曲肽注射液及21批注射用醋酸奥曲肽均未检出上述5种抑菌剂，表明国内生产醋酸奥曲肽的企业均无违规添加苯酚、苯甲醇、三氯叔丁醇、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯这5种抑菌剂的行为。
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